第一部分:雌激素影響MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和凋亡目的:本研究用不同濃度的β-雌二醇處理MC3T3-E1細(xì)胞,研究雌激素對(duì)成骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制,并獲得合適的處理濃度來進(jìn)行下一步的RNA深度測(cè)序?qū)嶒?yàn)。方法:用不同濃度的β-雌二醇處理小鼠成骨MC3T3-E1細(xì)胞,DMSO為對(duì)照組,觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化,然后利用CCK-8試劑盒來檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況,并且利用TUNEL試劑盒檢測(cè)不同濃度下MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:在低濃度(0.01n M和0.1n M)β-雌二醇的處理組中,細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的增殖和細(xì)胞的凋亡等細(xì)胞行為方面相對(duì)于DMSO對(duì)照組均未產(chǎn)生明顯的差異;在1n M和10n M高濃度β-雌二醇處理組中,細(xì)胞的形態(tài)在顯微鏡下觀察沒有明顯的差異,但是在細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞的增殖方面卻出現(xiàn)了顯著的差異,尤其在10n M處理組出現(xiàn)了極其顯著的差異。結(jié)論:10n Mβ-雌二醇為引起MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的最適濃度。本研究將選擇10n M的處理濃度來進(jìn)行下一步RNA深度測(cè)序,進(jìn)一步闡述雌激素作用于成骨細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制。第二部分RNA深度測(cè)序分析雌激素作用成骨細(xì)胞的基因和信號(hào)通路目的:為了更加深入地研究雌性激素對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制,內(nèi)在的靶向基因和信號(hào)通路,本研究利用雌激素處理小鼠MC3T3-E1細(xì)胞并進(jìn)行RNA深度測(cè)序,為深入闡述雌激素作用成骨細(xì)胞的內(nèi)在作用機(jī)制提供可能。方法:利用10n Mβ-雌二醇處理小鼠MC3T3-E1細(xì)胞,3天后收集處理細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞并進(jìn)行RNA提取,構(gòu)建兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組庫,進(jìn)行RNA測(cè)序分析,將處理結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。結(jié)果:相對(duì)于對(duì)照組,本研究在處理組中發(fā)現(xiàn)460個(gè)差異表達(dá)基因,在這些差異表達(dá)基因中,上調(diào)的基因有66個(gè),下調(diào)的基因有394個(gè)。利用這些差異表達(dá)基因,本研究進(jìn)行GO分類和pathway分析,發(fā)現(xiàn)許多骨代謝相關(guān)的生物過程和細(xì)胞信號(hào)通路紊亂。這些被富集的骨代謝相關(guān)的信號(hào)通路包括經(jīng)典的TGF-β信號(hào)通路,Wnt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。其中,在TGF-β信號(hào)通路中,Tgfbr1和Bmpr1a兩個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)明顯地被抑制。結(jié)論:雌激素影響了成骨細(xì)胞內(nèi)骨代謝基因表達(dá)和骨代謝相關(guān)的信號(hào)通路。第三部分雌激素作用于骨代謝關(guān)鍵基因的分子機(jī)制研究目的:在深度測(cè)序的差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)Tgfbr1和Bmpr1a兩個(gè)基因的表達(dá)明顯被抑制。本部分深入研究雌激素抑制Tgfbr1和Bmpr1a兩個(gè)基因的分子作用機(jī)制。方法:首先利用qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的基因,然后利用雌激素受體抑制劑分別處理MC3T3-E1細(xì)胞,檢測(cè)Tgfbr1和Bmpr1a兩個(gè)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子分析軟件發(fā)現(xiàn)Tgfbr1和Bmpr1a基因的啟動(dòng)子,存在有雌激素受體應(yīng)答原件,最后Ch IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證雌激素受體β對(duì)Tgfbr1和Bmpr1a啟動(dòng)子的綁定作用。結(jié)果:雌激素受體β參與了雌激素對(duì)Tgfbr1和Bmpr1a基因的抑制性作用,生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在Tgfbr1的啟動(dòng)子區(qū)域存在3個(gè)雌激素受體應(yīng)答原件,在Bmpr1a的啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)雌激素受體應(yīng)答原件。Ch IP實(shí)驗(yàn)證明,雌激素能夠增強(qiáng)雌激素受體β對(duì)Tgfbr1和Bmpr1a基因的綁定性作用。結(jié)論:雌激素通過雌激素受體β抑制Tgfbr1和Bmpr1a基因的表達(dá)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

1 不同濃度的 β-雌二醇處理后 MC3T3-E1 細(xì)胞的形態(tài)觀察（單位：不同濃度的 β-雌二醇對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)濃度的β-雌二醇處理MC3T3-E1細(xì)胞24小時(shí)后利用CCK-8來檢測(cè)果顯示：低濃度（0.01 和 0.1nM）處理組 MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖相對(duì)有出現(xiàn)明顯的差別(p>0.05)；在高濃度處理組（1 和 10nM）處理組 M殖相對(duì)于 DMSO 處理組分別出現(xiàn)了顯著性(p<0.05)和極其顯著性(異（圖 1-2）。這些結(jié)果說明了高濃度的處理組明顯地增加了 MC3。

同濃度的 β-雌二醇處理后 MC3T3-E1 細(xì)胞的形態(tài)觀察（單濃度的 β-雌二醇對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)度的β-雌二醇處理MC3T3-E1細(xì)胞24小時(shí)后利用CCK-8來檢示：低濃度（0.01 和 0.1nM）處理組 MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖相出現(xiàn)明顯的差別(p>0.05)；在高濃度處理組（1 和 10nM）處理相對(duì)于 DMSO 處理組分別出現(xiàn)了顯著性(p<0.05)和極其顯著（圖 1-2）。這些結(jié)果說明了高濃度的處理組明顯地增加了 M

利用 TUNEL 染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的 β-雌二醇對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞凋單位：nM據(jù)細(xì)胞的染色，本研究對(duì)選擇區(qū)域內(nèi)凋亡的細(xì)胞分別記數(shù)，然后統(tǒng)計(jì)分示（圖 1-4）。 根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果本研究能夠得出，在低濃度的處理組（β-雌二醇對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡相對(duì)于 DMSO 對(duì)照組沒有明顯)；在高濃度處理組（1 和 10nM），雌激素對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡相對(duì)于產(chǎn)生的凋亡數(shù)目明顯的增多，尤其是在 10nM 處理組，出現(xiàn)了極其顯著0.01）（圖 1-4）。
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本文編號(hào)：2883179