目的:探討左氧氟沙星誘導(dǎo)凋亡下大鼠纖維環(huán)細胞外基質(zhì)和基質(zhì)金屬蛋白酶的變化。方法:酶消化法來原代培養(yǎng)大鼠的纖維環(huán)細胞,貼壁的細胞融合為單層后傳代培養(yǎng),傳至第3代時,以不含胎牛血清以及酚紅的DMEM/HIGH GLUCOSE(1×)培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,分別按照濃度依賴和時間依賴分組實驗。濃度依賴組:按以下分組實驗,每組為6個樣本,對照組:以不含左氧氟沙星的培養(yǎng)液處理;10μg/ml組:加入濃度為10μg/ml的左氧氟沙星干預(yù);30μg/ml組:加入濃度為30μg/ml的左氧氟沙星干預(yù);60μg/ml組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù),90μg/ml組:加入濃度為90μg/ml的左氧氟沙星干預(yù);120μg/ml組:加入濃度為120μg/ml的左氧氟沙星干預(yù),以上各組細胞培養(yǎng)24小時。時間依賴組:按以下分組實驗,每組為6個樣本,對照組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)0小時;8小時組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)8小時;12小時組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)12小時;24小時組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)24小時,36小時組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)36小時;48小時組:加入濃度為60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)48小時。兩組實驗分別應(yīng)用:1應(yīng)用倒置相差顯微鏡來觀察大鼠的纖維環(huán)細胞形態(tài);2 caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3的活性;3細胞-膠原粘附實驗檢測細胞與Ⅰ型膠原的粘附水平;4用實時定量PCR法來檢測纖維環(huán)細胞中的MMP-2和MMP-13蛋白相關(guān)基因表達情況;5 western印跡法對MMP-2蛋白和MMP-13蛋白定量檢測。結(jié)果:1原代大鼠纖維環(huán)細胞多數(shù)呈現(xiàn)為長梭形,且輪廓明顯,細胞核呈現(xiàn)出圓形以及橢圓形,24~48小時后細胞可貼壁生長,8~9天細胞即進入其對數(shù)生長期。經(jīng)不同濃度左氧氟沙星干預(yù)24小時和60μg/ml的左氧氟沙星干預(yù)不同時間后觀察細胞出現(xiàn)細胞皺縮、空泡形成等凋亡征象;2用caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天)來檢測細胞中caspase-3的活性,結(jié)果顯示在濃度依次為10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml左氧氟沙星干預(yù)24小時后,細胞caspase-3的活性分別為對照組的1.81倍、3.22倍、4.23倍、5.54倍、6.56倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在左氧氟沙星(60μg/ml)依次干預(yù)0、8、12、24、36、48小時后,細胞caspase-3的活性分別為對照組的1.54倍、2.98倍、4.18倍、5.30倍、6.40倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);3細胞與Ⅰ型膠原的粘附水平實驗,濃度依賴組中各組OD值分別為對照組的0.91倍、0.83倍、0.76倍、0.70倍、0.60倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。時間依賴組中各組OD值分別為對照組的0.91倍、0.82倍、0.75倍、0.67倍、0.61倍,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);4實時定量PCR檢測,在濃度依賴組:MMP-2和MMP-13的2-△△Ct值分別為1.02±0.22、1.38±0.19、1.71±0.25、2.04±0.22、2.50±0.18、3.24±0.38;1.00±0.06、1.37±0.09、1.75±0.15、2.48±0.18、3.09±0.28、3.70±0.31,差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在時間依賴組:MMP-2的2-△△Ct值分別為1.01±0.15、1.23±0.11、1.64±0.21、2.07±0.38、3.05±0.15、3.53±0.22,對照組和8h組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),其余各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);MMP-13的2-△△Ct值分別為1.01±0.13、1.33±0.17、1.88±0.32、2.54±0.48、3.18±0.47、3.84±0.46,對照組和8h組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),其余各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);5用western印跡法來檢測大鼠纖維環(huán)細胞中MMP-2和MMP-13蛋白的表達。結(jié)果顯示:在濃度依賴組:MMP-2和MMP-13的灰度值(/GAPDH)分別為0.12±0.012、0.20±0.017、0.31±0.018、0.42±0.022、0.51±0.021、0.60±0.025;0.17±0.018、0.28±0.020、0.39±0.023、0.46±0.023、0.57±0.027、0.68±0.031。在時間依賴組:MMP-2和MMP-13的灰度值(/GAPDH)分別為0.10±0.012、0.19±0.023、0.32±0.027、0.41±0.027、0.52±0.031、0.65±0.035;0.16±0.019、0.26±0.024、0.35±0.023、0.48±0.027、0.57±0.031、0.66±0.040。在濃度依賴組和時間依賴組MMP-2和MMP-13的表達量差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:上述研究表明,左氧氟沙星對大鼠纖維環(huán)細胞的體外細胞毒作用的可能歸因于降低細胞與Ⅰ型膠原粘附能力和影響MMP-2和MMP-13表達。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R681.53
【部分圖文】：

A B圖 1 倒置相差顯微鏡觀察。（A）以不含胎牛血清以及酚紅的 DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)纖維環(huán)細胞，并且加入劑量為 0 至 120μg/mL 的左氧氟沙星干預(yù) 24 小時。（B）以不含胎牛血清以及酚紅的 DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)纖維環(huán)細胞，并且加入劑量為 60μg/mL 的左氧氟沙星干預(yù) 0 至 48 小時Fig. 1 Morphological observation. (A) AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 0 to 120 μg/mL levofloxacin for24 h. (B)AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 60 μg/mL levofloxacin for 0 to 48 h. Apoptotic cells werecharacterized by plasma membrane blebbing, cell shrinkage and nuclei condensingand

A BAB圖 1 倒置相差顯微鏡觀察。（A）以不含胎牛血清以及酚紅的 DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)纖維環(huán)細胞，并且加入劑量為 0 至 120μg/mL 的左氧氟沙星干預(yù) 24 小時。（B）以不含胎牛血清以及酚紅的 DMEM/F12 培養(yǎng)液培養(yǎng)纖維環(huán)細胞，并且加入劑量為 60μg/mL 的左氧氟沙星干預(yù) 0 至 48 小時Fig. 1 Morphological observation. (A) AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 0 to 120 μg/mL levofloxacin for24 h. (B)AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 60 μg/mL levofloxacin for 0 to 48 h. Apoptotic cells werecharacterized by plasma membrane blebbing, cell shrinkage and nuclei condensingand圖 2 左氧氟沙星上調(diào) MMP-2 和 MMP-13 蛋白表達。纖維環(huán)細胞處理同前，用蛋白免疫印跡法分析 MMP-2 和MMP-13 蛋白表達。（A）左氧氟沙星以劑量依賴方式上調(diào) MMP-2 蛋白表達，影響 MMP-13 蛋白表達。（B）左氧
【參考文獻】

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1 流小舟;徐海棟;周光新;趙建寧;;椎間盤退變中基質(zhì)金屬蛋白酶作用的研究進展[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報;2015年11期

本文編號：2883499