顱腦創(chuàng)傷(Traumatic Brain Injury,TBI)致死率、致殘率居高不下,從輕型到重型TBI均給患者和家屬帶來沉重的負(fù)擔(dān)。戰(zhàn)爭時(shí)期,TBI是士兵傷亡類型中的主要形式,其具備表現(xiàn)的多樣性、發(fā)展的迅速性、預(yù)后差異性等特點(diǎn)。TBI后會伴隨著局部腦組織缺血、缺氧及血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的破壞最終會導(dǎo)致腦組織的水腫,而腦水腫又加重神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧的程度,形成惡性循。隨著交通的發(fā)達(dá),車禍所致的顱腦損傷也逐年增加,如何進(jìn)一步提高TBI后患者的救治,將成為國內(nèi)外神經(jīng)外科醫(yī)生研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明,缺血預(yù)處理對維持BBB的完整通透性和減輕腦細(xì)胞水腫程度發(fā)揮作用,對改善其預(yù)后產(chǎn)生積極作用。缺氧預(yù)處理(Hypoxic Preconditioning,HPC)是指給予短時(shí)間單次或多次缺氧刺激后,可在機(jī)體各個(gè)組織內(nèi)激發(fā)自身保護(hù)作用,在抗缺血、缺氧的神經(jīng)保護(hù)功能上發(fā)揮作用;同時(shí)其具備安全、有效、可重復(fù)等特點(diǎn)。HPC對神經(jīng)元細(xì)胞起到保護(hù)作用,維持BBB完整性從而減低了腦水腫發(fā)生的程度,目前關(guān)于HPC在TBI后干預(yù)腦細(xì)胞的重構(gòu)與保護(hù)機(jī)理尚處在研究階段,神外�？祁I(lǐng)域也少有報(bào)道。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1,SphK1)是體內(nèi)將鞘氨醇(sphingosine Sph)催化為1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P)的一種關(guān)鍵酶,SphK2因其催化活性以及細(xì)胞的特殊定位而影響著細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平及神經(jīng)細(xì)胞凋亡,在腦損傷后其表達(dá)的上調(diào)對腦神經(jīng)細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用~([1])。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察缺氧預(yù)處理(HPC)對于創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織中SphK2的表達(dá)變化以及對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響,為TBI后患者成功的救治提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。第一部分創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織SphK2表達(dá)變化以及血腦屏障通透性變化的實(shí)驗(yàn)研究目的探討創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織中鞘氨醇激酶2表達(dá)及血腦屏障(blood brain barrier,BBB)的變化規(guī)律。方法108只大鼠(成年雄性健康Sprague-Dawley大鼠)隨機(jī)分組為創(chuàng)傷性腦損傷組(TBI組n=96)以及對照組(Con組n=12),采用改良的Feeney’s自由落體打擊法建立大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型。TBI組于傷后1h、4h、8h、12h、24h、3d、7d、14d斷頭處死。Con組僅做頭皮切開縫合處理。分別應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白質(zhì)印跡法(Western-Blotting)及免疫組化檢測各組大鼠挫傷區(qū)周圍皮層腦組織鞘氨醇激酶2的表達(dá)變化、干濕重法測腦組織含水量、免疫組化IgG法檢測血腦屏障通透性變化情況。結(jié)果RT-PCR法檢測SphK2 mRNA發(fā)現(xiàn),在TBI后1h即開始表達(dá),12h達(dá)到峰值狀態(tài),1d-14d呈下降趨勢;傷后1h-7dTBI組表達(dá)較Con組明顯增加,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western-Blotting法檢測蛋白情況發(fā)現(xiàn),TBI組傷后1h開始出現(xiàn)SphK2蛋白表達(dá),4h-12h呈上升趨勢,傷后12h達(dá)峰值,1d-14天呈下降趨勢。其中TBI組傷后1h-14d SphK2蛋白表達(dá)較Con組(0.18±0.10)明顯增加,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。IgG染色及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)傷后1h出現(xiàn)陽性細(xì)胞表達(dá),12小時(shí)黃染最為明顯,傷后1d-14d染色逐漸變淡,干濕重法測腦細(xì)胞含水量發(fā)現(xiàn),1h-1d呈上升趨勢,3d達(dá)峰值,隨后逐漸下降,傷后1h-7d TBI組與Con組腦組織水含量比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),傷后14d兩組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論大鼠遭受顱腦創(chuàng)傷后血腦屏障的完整性受到破壞,同時(shí)應(yīng)激性的導(dǎo)致SphK2表達(dá)增加,SphK2表達(dá)增加可能在維持血腦屏障的完整性方面起重要作用。第二部分SphK-2參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究目的探討HPC對大鼠TBI后SphK2的表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,研究HPC參與大鼠顱腦創(chuàng)傷后的腦保護(hù)機(jī)制。方法選取健康成年(S-D)大鼠204只,體重范圍約260-290 g,均購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,由實(shí)驗(yàn)室動物L(fēng)AB精心管理喂養(yǎng),大鼠均為健康成年大鼠(根據(jù)毛發(fā)判斷),按科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)精心飼養(yǎng),定時(shí)、定餐、定量喂食水,大鼠生活環(huán)境為我院實(shí)驗(yàn)室多層鐵籠裝置,保持室內(nèi)通風(fēng)同時(shí)維持室溫范圍在23--25℃之間。采用隨機(jī)數(shù)字法分成缺氧預(yù)處理后致顱腦創(chuàng)傷組(HPC組)96只及單純TBI組96只,對照組(Con組)12只,其中HPC組和單純TBI組分為傷后1h,4h,8h,12h,1d,3d,7d,14d 8個(gè)亞組,每個(gè)亞組12只。采用改良的Feeney’s方式(同前)制作TBI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將大鼠預(yù)先予以低壓氧倉內(nèi)訓(xùn)練3h/d,連續(xù)3d制作HPC動物模型,采用IgG法免疫組化染色、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及Western Blotting方法檢測鞘氨醇激酶2(SphK2)基因及蛋白的表達(dá)、TUNEL法染色檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化情況。結(jié)果(1)正常腦組織(con組)IgG無染色,TBI組腦外傷后1h即可見IgG輕微染色陽性細(xì)胞,傷后4h-8h染色逐漸變深,12h IgG黃染最明顯,1d-14d呈下降趨勢,傷后1h-7d HPC組IgG評分均低于TBI組,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)RT-PCR及Western Blotting法檢測結(jié)果顯示,SphK-2在顱腦外傷后1h開始表達(dá),4h-8h表達(dá)逐漸升高,12h到達(dá)峰值,1d-14d表達(dá)呈下降趨勢,傷后1h-7d時(shí)間段SphK2 mRNA及蛋白表達(dá)HPC組比TBI組明顯升高,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05))。(3)TUNEL染色檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),單純TBI組和HPC組于顱腦損傷后1d凋亡細(xì)胞開始表達(dá),3d達(dá)最高峰,傷后3d-7d時(shí)間段呈下降趨勢。神經(jīng)細(xì)胞凋亡率HPC組較單純TBI組明顯減低,兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論HPC顯著增加大鼠腦損傷后Sphk2表達(dá),降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮腦保護(hù)的作用。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R651.15
【文章目錄】：
英文縮寫對照表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織SphK2表達(dá)變化以及血腦屏障通透性變化的實(shí)驗(yàn)研究
    1 材料與方法
    2.相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.討論
    4.結(jié)論
第二部分 SphK2參與缺氧預(yù)處理減輕大鼠顱腦創(chuàng)傷后表達(dá)變化及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
    1 材料與方法
    2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.討論
    4.結(jié)論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2879957