[目的]研究金葡菌及其菌壁蛋白SpA、PGN、LTA對破骨細胞分化形成及骨吸收的作用,并探討金葡菌、SpA、PGN、LTA促進破骨細胞分化形成的相關(guān)分子機制。[方法]1.MTT試驗,將RAW264.7細胞種植于96孔細胞培養(yǎng)板,以不同感染復數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-1600ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7細胞,分別培養(yǎng)1、3、5天。在對應時間點,對相應的96孔板進行MTT試驗,檢測各刺激物對RAW264.7細胞增殖活性的影響。2.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色),將RAW264.7細胞種植于96孔細胞培養(yǎng)板,以不同感染復數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7細胞,在各刺激物作用后的第5天,對各實驗組的96孔板進行TRAP染色,檢測各實驗組破骨樣細胞的形成情況,并計數(shù)每孔破骨樣細胞的數(shù)目。為研究NF-κB信號通路的作用,在各刺激物加入前1小時加入20μM的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性抑制劑JSH-23,JSH-23共作用25小時后撤出,重復該部分實驗。3.骨吸收凹陷實驗,將RAW264.7細胞種植于24孔COAS骨吸收活性檢測板上,以不同感染復數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于 RAW264.7 細胞,在各刺激物作用后的第5天,移除各實驗組24孔COAS板內(nèi)的培養(yǎng)基及細胞,檢測各實驗組骨吸收凹陷的形成情況,并在200倍鏡的視野下,用軟件計算各實驗組骨吸收凹陷的累積面積占該視野面積的比值。為研究NF-κB信號通路的作用,在各刺激物加入前1小時加入20μM的JSH-23,重復該部分實驗。4.實時熒光定量PCR(RT-PCR)實驗,將RAW264.7細胞種植于6孔細胞培養(yǎng)板上,以不同感染復數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)作用于RAW264.7細胞,在各刺激物作用后的第5天,使用RT-PCR檢測破骨細胞標志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2的表達情況。為研究NF-κB信號通路的作用,在各刺激物加入前1小時加入20μM的JSH-23,重復該項實驗。5.Western blot實驗,將RAW264.7細胞傳代培養(yǎng)于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi),待細胞生長并鋪滿瓶底約80%時,換液后分別以感染復數(shù)為20:1的金葡菌活菌、濃度為400ng/ml的SpA、200ng/ml 的 PGN 及 LTA,作用于 RAW264.7 細胞 0、5、10、20、40 及60分鐘,在預定時間點收集細胞,通過westerrn blot方法檢測ERK1/2、p38、JNK、NF-κB p65、IκB-α、Akt及其磷酸化蛋白的表達情況。為進行NFATc1的檢測,將RAW264.7細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板,然后使用金葡菌、SpA、PGN及LTA對其進行誘導培養(yǎng),金葡菌活菌感染RAW264.7細胞24小時后撤出,而400ng/ml的SpA、200ng/ml的PGN及LTA則持續(xù)作用于RAW264.7細胞,細胞分別培養(yǎng)0、1、2及3天,在對應時間點收集細胞,通過westernblot檢測NFATcl的表達情況。為研究NF-κB與NFATc1的關(guān)系,在各刺激物加入前1小時加入20μM的JSH-23,重復該部分實驗。6.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)實驗,將RAW264.7細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板上,以感染復數(shù)為5-40:1的金葡菌活菌、50-800ng/ml的SpA、100-400ng/ml的PGN及LTA作用于RAW264.7細胞,細胞分別培養(yǎng)1、2、3天,在預定時間點收集上清液,通過ELISA檢測IL-6、IL-1α及TNF-α的表達情況。[結(jié)果]1.MTT實驗結(jié)果:金葡菌活菌在感染復數(shù)為5:1及10:1時,其對RAW264.7細胞的增殖活性無影響,在感染復數(shù)為20:1及40:1時,其抑制了RAW264.7細胞的增殖活性。SpA作用于RAW264.7細胞的第一天,在100-400ng/ml的濃度下,SpA促進了 RAW264.7細胞的增殖,在50及800ng/ml的濃度下,SpA對RAW264.7細胞的增殖活性無影響,但在1600ng/ml的濃度下,SpA抑制了 RAW264.7細胞的增殖;SpA作用于RAW264.7細胞的第3及第5天,在50-800ng/ml的濃度下,SpA對RAW264.7細胞的增殖活性無影響,但在1600ng/ml的濃度下,SpA抑制了 RAW264.7細胞的增殖。實驗所用感染復數(shù)下的金葡菌滅活菌,以及實驗所用濃度下的金葡菌濾液、PGN、LTA,對RAW264.7細胞的增殖活性無影響。2.TRAP染色結(jié)果,金葡菌活菌、滅活菌、金葡菌濾液、SpA、PGN及LTA均以劑量依賴的方式促進了破骨樣細胞的形成,隨上述刺激物劑量的逐步增加,破骨樣細胞的形成數(shù)目逐漸增加。但在加入JSH-23后,上述各實驗組破骨樣細胞的形成數(shù)目明顯降低,與相同劑量下未加入JSH-23的組比較,差異均有統(tǒng)計學意義。此外,在RANKL的存在下,SpA誘導形成的破骨細胞的數(shù)目明顯增加,均高于相同濃度下未加入RANKL組所形成的數(shù)目。3.骨吸收凹陷實驗結(jié)果,金葡菌活菌、滅活菌、金葡菌濾液、SpA、PGN及LTA均以劑量依賴的方式促進了骨吸收凹陷的形成,隨上述刺激物劑量的逐步增加,骨吸收凹陷的面積逐漸增加。但在加入JSH-23后,上述各實驗組骨吸收凹陷的面積明顯降低,與相同劑量下未加入JSH-23的組比較,差異均有統(tǒng)計學意義。此外,在RANKL的存在下,SpA誘導形成的骨吸收凹陷的面積明顯增加,均高于相同濃度下未加入RANKL組所形成的面積。4.PT-PCR實驗結(jié)果,金葡菌活菌、滅活菌、金葡菌濾液及SpA均以劑量依賴的方式促進了破骨細胞標志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2 的表達增高,隨上述刺激物作用劑量的逐步增加,破骨細胞標志性基因的表達逐漸增高。但在加入JSH-23后,上述各實驗組破骨細胞標志性基因的表達均明顯降低,與相同劑量下未加入JSH-23的組比較,差異均有統(tǒng)計學意義。此外,在RANKL的存在下,SpA誘導的破骨細胞標志性基因的表達,均高于相同濃度下未加入RANKL組所誘導的表達。5.Westem blot實驗結(jié)果,在金葡菌活菌或SpA的作用下,IκB-α在其作用后的10min時表達明顯降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min時表達增高。在PGN的作用下,IκB-α的表達在5min及l(fā)Omin時明顯降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min時表達增高。在LTA的作用下,IκB-α的表達在5min及10min時降低,10min時降低更明顯,而磷酸化的NF-κB p65在10min時表達明顯增高。ERK1/2、p38、JNK、Akt及其磷酸化蛋白的表達,在金葡菌、SpA、PGN及LTA的作用下無明顯變化。NFATcl的表達在金葡菌、SpA、PGN及LTA作用后的第2及第3天的表達逐漸增高,但加入JSH-23后,NFATc1在第2及第3天的表達明顯低于未加入JSH-23時的表達。6.ELISA實驗結(jié)果,在金葡菌感染下,IL-6、IL-1α及TNF-α在第2及第3天的表達,隨金葡菌感染復數(shù)的增加及培養(yǎng)時間的延長,其表達逐漸增高。在SpA、PGN及LTA的作用下,IL-6在第2及第3天的表達隨SpA、PGN及LTA濃度的增加及培養(yǎng)時間的延長,其表達逐漸增高,但IL-lα及TNF-α無明顯表達。[結(jié)論]1.金葡菌具有促進破骨細胞分化形成及促進骨吸收的作用,該作用是金葡菌的菌壁成分及其分泌的活性分子的共同作用。2.金葡菌的菌壁蛋白SpA、PGN及LTA同樣具有促進破骨細胞分化形成及促進骨吸收的作用。3.NF-κB信號通路在金葡菌、SpA、PGN及LTA誘導的破骨細胞的分化形成及骨吸收過程中起重要作用。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R681.2
【部分圖文】：

１０｜ｉｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ的金葡菌濾液，以及等體積的ＰＢＳ?（ｃｏｎｔｒｏｌ組）。對于金葡菌??活菌組，換液后加入無抗生素的培養(yǎng)基（１５％ＦＢＳ＋８５％的高糖ＤＭＥＭ），并在對??應孔內(nèi)加入感染復數(shù)為５：１、１０：１、２０：１及４０：１的活菌（感染情況見圖２），活菌??感染２４小時后使用抗生素（苯唑西林鈉）將其滅活，并使用含苯唑西林鈉的ＰＢＳ??溶液，漂洗各培養(yǎng)孔２－３遍后，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。添加刺激物后，細胞??分別培養(yǎng)１天、３天及５天；每２－３天換液一次，換液后重新加入金葡菌滅活菌、??金葡菌濾液及ＰＢＳ，活菌組不再進行重復感染，僅進行換液。在預定的培養(yǎng)時間??１７??

ＲＡＷ２６４．?７細胞分別培養(yǎng)１、３、５天后，感染復數(shù)為５：１及１０：１時，其??０Ｄ值與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義；但感染復數(shù)為２０：１及４０：１時，其??０Ｄ值與對應時間點對照組的０Ｄ值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（見圖３）?＾感??染復數(shù)為２０：１及４０：１組的０Ｄ值均低于對照組的０Ｄ值，表明感染復數(shù)在５：１??及１０：１時，金葡菌對ＲＡＷ２６４．?７細胞的增值活性無影響；但感染復數(shù)在２０：１及??４０：１時，金葡菌活菌對ＲＡＷ２６４．?７細胞具有細胞毒性，抑制了其生長。??ＭＴＴ?ａｓｓａｙ??２?５?１?ｄａｙ?Ｅ３?３?ｄａｙｓ?ｍ?５?ｄａｙｓ??ｆ２－°－?ｎｉｌ?１１１１?ｊ?ｊ??＿＿??＾?＾??ｚ?／?／?／?／?／?／ＶＶＶ??ｙ?＾?＾?＾?＾?／?／??，，??２４??

金葡菌濾液１０｜ｉｇ／ｍｌ組（７１．９±４．２個／孔）、金葡菌濾液２０（ｉｇ／ｍｌ組（１５４．３±５．２??個／？Ｌ）。在相同感染復數(shù)及相同濃度下，與未加入ＪＳＨ－２３的對應組比較，差異??均有統(tǒng)計學意義（見圖４－Ｄ），加入ＪＳＨ－２３后所形成的破骨樣細胞的數(shù)目，均少??于未加入ＪＳＨ－２３的對應組所形成的破骨樣細胞的數(shù)目。??＼?ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?５：１??＿＿＿??Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?１０：１?Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?２０：１??ｍｄ?ｉ?ｍｉ??■…４．：銷＇）??２６??
【參考文獻】

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1 任莉榮;王海;何曉清;宋慕國;陳學秋;徐永清;;金葡菌脂磷壁酸促進破骨細胞分化的分子機制[J];實用醫(yī)學雜志;2016年20期

2 許丹;律穎;朱小語;陳曉文;馮金秋;范愛琴;許雅君;;小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)的培養(yǎng)及其在誘導破骨細胞中的應用[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2016年10期

3 任莉榮;徐永清;王海;何曉清;宋慕國;陳學秋;;金黃色葡萄球菌肽聚糖促進破骨細胞分化的分子機制研究[J];中國修復重建外科雜志;2016年10期

4 任莉榮;徐永清;王海;何曉清;宋慕國;陳學秋;;金黃色葡萄球菌肽聚糖對破骨細胞分化的影響研究[J];中國修復重建外科雜志;2016年08期

5 任莉榮;徐永清;;破骨細胞分化機制的研究進展[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2015年12期

6 廖明喻;逄龍;楊婭麗;馬笑雪;;金黃色葡萄球菌主要毒力因子對宿主固有免疫系統(tǒng)的影響[J];微生物學雜志;2015年05期

7 任莉榮;舒鈞;;核因子κB的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2011年06期

8 肖新華;廖二元;董源媛;趙向;劉江華;曹仁賢;文格波;;小鼠單核細胞RAW264.7的細胞生物學特征[J];南華大學學報(醫(yī)學版);2008年03期

9 朱建民,方浩,陳新剛,曾明,金蔚芳,王洪復;骨折愈合刺激素(金葡液)對體外培養(yǎng)成骨細胞的影響[J];中國臨床康復;2002年07期

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1 丁丁;金葡液有效成分鑒定及重組金葡菌腸毒素生物學活性研究[D];浙江大學;2009年

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1 張騫;金黃色葡萄球菌濾液中成分研究[D];吉林大學;2004年

本文編號：2877939