[目的]研究金葡菌及其菌壁蛋白SpA、PGN、LTA對破骨細(xì)胞分化形成及骨吸收的作用,并探討金葡菌、SpA、PGN、LTA促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成的相關(guān)分子機(jī)制。[方法]1.MTT試驗(yàn),將RAW264.7細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,以不同感染復(fù)數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-1600ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7細(xì)胞,分別培養(yǎng)1、3、5天。在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn),對相應(yīng)的96孔板進(jìn)行MTT試驗(yàn),檢測各刺激物對RAW264.7細(xì)胞增殖活性的影響。2.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色),將RAW264.7細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,以不同感染復(fù)數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7細(xì)胞,在各刺激物作用后的第5天,對各實(shí)驗(yàn)組的96孔板進(jìn)行TRAP染色,檢測各實(shí)驗(yàn)組破骨樣細(xì)胞的形成情況,并計(jì)數(shù)每孔破骨樣細(xì)胞的數(shù)目。為研究NF-κB信號通路的作用,在各刺激物加入前1小時(shí)加入20μM的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性抑制劑JSH-23,JSH-23共作用25小時(shí)后撤出,重復(fù)該部分實(shí)驗(yàn)。3.骨吸收凹陷實(shí)驗(yàn),將RAW264.7細(xì)胞種植于24孔COAS骨吸收活性檢測板上,以不同感染復(fù)數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于 RAW264.7 細(xì)胞,在各刺激物作用后的第5天,移除各實(shí)驗(yàn)組24孔COAS板內(nèi)的培養(yǎng)基及細(xì)胞,檢測各實(shí)驗(yàn)組骨吸收凹陷的形成情況,并在200倍鏡的視野下,用軟件計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組骨吸收凹陷的累積面積占該視野面積的比值。為研究NF-κB信號通路的作用,在各刺激物加入前1小時(shí)加入20μM的JSH-23,重復(fù)該部分實(shí)驗(yàn)。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn),將RAW264.7細(xì)胞種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,以不同感染復(fù)數(shù)的金葡菌活菌(5-40:1)、滅活菌(10-40:1),以及不同濃度的金葡菌濾液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)作用于RAW264.7細(xì)胞,在各刺激物作用后的第5天,使用RT-PCR檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2的表達(dá)情況。為研究NF-κB信號通路的作用,在各刺激物加入前1小時(shí)加入20μM的JSH-23,重復(fù)該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。5.Western blot實(shí)驗(yàn),將RAW264.7細(xì)胞傳代培養(yǎng)于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),待細(xì)胞生長并鋪滿瓶底約80%時(shí),換液后分別以感染復(fù)數(shù)為20:1的金葡菌活菌、濃度為400ng/ml的SpA、200ng/ml 的 PGN 及 LTA,作用于 RAW264.7 細(xì)胞 0、5、10、20、40 及60分鐘,在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,通過westerrn blot方法檢測ERK1/2、p38、JNK、NF-κB p65、IκB-α、Akt及其磷酸化蛋白的表達(dá)情況。為進(jìn)行NFATc1的檢測,將RAW264.7細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,然后使用金葡菌、SpA、PGN及LTA對其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),金葡菌活菌感染RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)后撤出,而400ng/ml的SpA、200ng/ml的PGN及LTA則持續(xù)作用于RAW264.7細(xì)胞,細(xì)胞分別培養(yǎng)0、1、2及3天,在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,通過westernblot檢測NFATcl的表達(dá)情況。為研究NF-κB與NFATc1的關(guān)系,在各刺激物加入前1小時(shí)加入20μM的JSH-23,重復(fù)該部分實(shí)驗(yàn)。6.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)實(shí)驗(yàn),將RAW264.7細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,以感染復(fù)數(shù)為5-40:1的金葡菌活菌、50-800ng/ml的SpA、100-400ng/ml的PGN及LTA作用于RAW264.7細(xì)胞,細(xì)胞分別培養(yǎng)1、2、3天,在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集上清液,通過ELISA檢測IL-6、IL-1α及TNF-α的表達(dá)情況。[結(jié)果]1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果:金葡菌活菌在感染復(fù)數(shù)為5:1及10:1時(shí),其對RAW264.7細(xì)胞的增殖活性無影響,在感染復(fù)數(shù)為20:1及40:1時(shí),其抑制了RAW264.7細(xì)胞的增殖活性。SpA作用于RAW264.7細(xì)胞的第一天,在100-400ng/ml的濃度下,SpA促進(jìn)了 RAW264.7細(xì)胞的增殖,在50及800ng/ml的濃度下,SpA對RAW264.7細(xì)胞的增殖活性無影響,但在1600ng/ml的濃度下,SpA抑制了 RAW264.7細(xì)胞的增殖;SpA作用于RAW264.7細(xì)胞的第3及第5天,在50-800ng/ml的濃度下,SpA對RAW264.7細(xì)胞的增殖活性無影響,但在1600ng/ml的濃度下,SpA抑制了 RAW264.7細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)所用感染復(fù)數(shù)下的金葡菌滅活菌,以及實(shí)驗(yàn)所用濃度下的金葡菌濾液、PGN、LTA,對RAW264.7細(xì)胞的增殖活性無影響。2.TRAP染色結(jié)果,金葡菌活菌、滅活菌、金葡菌濾液、SpA、PGN及LTA均以劑量依賴的方式促進(jìn)了破骨樣細(xì)胞的形成,隨上述刺激物劑量的逐步增加,破骨樣細(xì)胞的形成數(shù)目逐漸增加。但在加入JSH-23后,上述各實(shí)驗(yàn)組破骨樣細(xì)胞的形成數(shù)目明顯降低,與相同劑量下未加入JSH-23的組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,在RANKL的存在下,SpA誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞的數(shù)目明顯增加,均高于相同濃度下未加入RANKL組所形成的數(shù)目。3.骨吸收凹陷實(shí)驗(yàn)結(jié)果,金葡菌活菌、滅活菌、金葡菌濾液、SpA、PGN及LTA均以劑量依賴的方式促進(jìn)了骨吸收凹陷的形成,隨上述刺激物劑量的逐步增加,骨吸收凹陷的面積逐漸增加。但在加入JSH-23后,上述各實(shí)驗(yàn)組骨吸收凹陷的面積明顯降低,與相同劑量下未加入JSH-23的組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,在RANKL的存在下,SpA誘導(dǎo)形成的骨吸收凹陷的面積明顯增加,均高于相同濃度下未加入RANKL組所形成的面積。4.PT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果,金葡菌活菌、滅活菌、金葡菌濾液及SpA均以劑量依賴的方式促進(jìn)了破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2 的表達(dá)增高,隨上述刺激物作用劑量的逐步增加,破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)逐漸增高。但在加入JSH-23后,上述各實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá)均明顯降低,與相同劑量下未加入JSH-23的組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,在RANKL的存在下,SpA誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞標(biāo)志性基因的表達(dá),均高于相同濃度下未加入RANKL組所誘導(dǎo)的表達(dá)。5.Westem blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在金葡菌活菌或SpA的作用下,IκB-α在其作用后的10min時(shí)表達(dá)明顯降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min時(shí)表達(dá)增高。在PGN的作用下,IκB-α的表達(dá)在5min及l(fā)Omin時(shí)明顯降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min時(shí)表達(dá)增高。在LTA的作用下,IκB-α的表達(dá)在5min及10min時(shí)降低,10min時(shí)降低更明顯,而磷酸化的NF-κB p65在10min時(shí)表達(dá)明顯增高。ERK1/2、p38、JNK、Akt及其磷酸化蛋白的表達(dá),在金葡菌、SpA、PGN及LTA的作用下無明顯變化。NFATcl的表達(dá)在金葡菌、SpA、PGN及LTA作用后的第2及第3天的表達(dá)逐漸增高,但加入JSH-23后,NFATc1在第2及第3天的表達(dá)明顯低于未加入JSH-23時(shí)的表達(dá)。6.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在金葡菌感染下,IL-6、IL-1α及TNF-α在第2及第3天的表達(dá),隨金葡菌感染復(fù)數(shù)的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長,其表達(dá)逐漸增高。在SpA、PGN及LTA的作用下,IL-6在第2及第3天的表達(dá)隨SpA、PGN及LTA濃度的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長,其表達(dá)逐漸增高,但I(xiàn)L-lα及TNF-α無明顯表達(dá)。[結(jié)論]1.金葡菌具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成及促進(jìn)骨吸收的作用,該作用是金葡菌的菌壁成分及其分泌的活性分子的共同作用。2.金葡菌的菌壁蛋白SpA、PGN及LTA同樣具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成及促進(jìn)骨吸收的作用。3.NF-κB信號通路在金葡菌、SpA、PGN及LTA誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的分化形成及骨吸收過程中起重要作用。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R681.2
【部分圖文】：

１０｜ｉｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ的金葡菌濾液，以及等體積的ＰＢＳ?（ｃｏｎｔｒｏｌ組）。對于金葡菌??活菌組，換液后加入無抗生素的培養(yǎng)基（１５％ＦＢＳ＋８５％的高糖ＤＭＥＭ），并在對??應(yīng)孔內(nèi)加入感染復(fù)數(shù)為５：１、１０：１、２０：１及４０：１的活菌（感染情況見圖２），活菌??感染２４小時(shí)后使用抗生素（苯唑西林鈉）將其滅活，并使用含苯唑西林鈉的ＰＢＳ??溶液，漂洗各培養(yǎng)孔２－３遍后，使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。添加刺激物后，細(xì)胞??分別培養(yǎng)１天、３天及５天；每２－３天換液一次，換液后重新加入金葡菌滅活菌、??金葡菌濾液及ＰＢＳ，活菌組不再進(jìn)行重復(fù)感染，僅進(jìn)行換液。在預(yù)定的培養(yǎng)時(shí)間??１７??

ＲＡＷ２６４．?７細(xì)胞分別培養(yǎng)１、３、５天后，感染復(fù)數(shù)為５：１及１０：１時(shí)，其??０Ｄ值與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但感染復(fù)數(shù)為２０：１及４０：１時(shí)，其??０Ｄ值與對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對照組的０Ｄ值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖３）?＾感??染復(fù)數(shù)為２０：１及４０：１組的０Ｄ值均低于對照組的０Ｄ值，表明感染復(fù)數(shù)在５：１??及１０：１時(shí)，金葡菌對ＲＡＷ２６４．?７細(xì)胞的增值活性無影響；但感染復(fù)數(shù)在２０：１及??４０：１時(shí)，金葡菌活菌對ＲＡＷ２６４．?７細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，抑制了其生長。??ＭＴＴ?ａｓｓａｙ??２?５?１?ｄａｙ?Ｅ３?３?ｄａｙｓ?ｍ?５?ｄａｙｓ??ｆ２－°－?ｎｉｌ?１１１１?ｊ?ｊ??＿＿??＾?＾??ｚ?／?／?／?／?／?／ＶＶＶ??ｙ?＾?＾?＾?＾?／?／??，，??２４??

金葡菌濾液１０｜ｉｇ／ｍｌ組（７１．９±４．２個(gè)／孔）、金葡菌濾液２０（ｉｇ／ｍｌ組（１５４．３±５．２??個(gè)／？Ｌ）。在相同感染復(fù)數(shù)及相同濃度下，與未加入ＪＳＨ－２３的對應(yīng)組比較，差異??均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖４－Ｄ），加入ＪＳＨ－２３后所形成的破骨樣細(xì)胞的數(shù)目，均少??于未加入ＪＳＨ－２３的對應(yīng)組所形成的破骨樣細(xì)胞的數(shù)目。??＼?ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?５：１??＿＿＿??Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?１０：１?Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?２０：１??ｍｄ?ｉ?ｍｉ??■…４．：銷＇）??２６??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2877939