目的:探討趨化因子受體CXCR3(CXC subfamily chemokine receptor 3,CXCR3)和血紅素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)基因聯(lián)合修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在減輕小腸移植排斥反應(yīng)和修復(fù)移植小腸功能的作用及其作用機(jī)制。方法:1.采用SPF級的健康的雄性Lewis大鼠,提取股骨和脛骨骨髓,使用全骨髓貼壁篩選法制備BMMSCs,并通過對BMMSCs的生長形態(tài)、分化能力和表面標(biāo)記進(jìn)行鑒定。2.將載有不同目的基因的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)BMMSCs,制備腺病毒空載的BMMSCs(Ad/BMMSCs)、載有HO-1基因的BMMSCs(Ad-HO-1/BMMSCs)、載有CXCR3基因的BMMSCs(Ad-CXCR3/BMMSCs)和載有CXCR3以及HO-1基因的BMMSCs(Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs)。3.使用TNF-α處理大鼠腸上皮細(xì)胞(IEC-6),制備腸上皮損傷模型;將損傷的IEC-6細(xì)胞與不同的BMMSCs以及正常淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng);通過結(jié)晶紫染色法和活細(xì)胞工作站法檢測不同BMMSCs的趨化能力,Western blot、RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測p38-MAPK通路的相關(guān)分子的表達(dá)情況,細(xì)胞流式術(shù)和ELISA方法檢測T淋巴細(xì)胞活性。4.以Brown Norway大鼠為實(shí)驗(yàn)供體,Lewis大鼠為實(shí)驗(yàn)受體,建立異位大鼠小腸移植排斥反應(yīng)模型。術(shù)前給予預(yù)處理,在術(shù)后0 h、1 d、3 d、7 d、10 d和14 d搜集各組的標(biāo)本。觀察大鼠的生存狀態(tài)以及生存時(shí)間并做生存率分析。通過蘇木素-伊紅染色分析腸道的排斥和損傷情況,Western blot、RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測小腸組織中HO-1、CXCR3以及p38-MAPK通路的相關(guān)分子的表達(dá)情況,基因芯片篩選差異基因。通過細(xì)胞流式術(shù)檢測脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平,乳酸脫氫酶法檢測全血NK細(xì)胞活性,ELISA方法檢測各組血清中促炎和抗炎因子以及二胺氧化酶的含量。結(jié)果:1.采用全骨髓貼壁篩選法可以成功獲得BMMSCs。獲得的Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs生物學(xué)特性與BMMSCs相比均未有改變。2.IEC-6能夠在體外成功建立腸道細(xì)胞損傷模型;以BN大鼠為供體,Lewis大鼠為受體能夠建立穩(wěn)定的小腸移植急性排斥反應(yīng)模型。3.基因芯片篩選出的差異基因與p38-MAPK信號通路相關(guān)。4.Western blot、RT-PCR和免疫組化技術(shù)檢測可發(fā)現(xiàn)BMMSCs能夠抑制受損細(xì)胞的p38-MAPK蛋白的磷酸化,使得p38-MAPK通路下游分子ATF2、CHOP10和MEF2C的磷酸化被抑制,凋亡減少,PCNA和ZO-1的表達(dá)增加。其中Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs的作用最顯著,且有CXCR3修飾的BMMSCs降低T淋巴細(xì)胞活性更明顯。5.在異基因異位小腸移植排斥反應(yīng)模型中,給以CXCR3和HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs治療能夠更明顯的延長受體大鼠的生存時(shí)間;且能夠更明顯的降低促炎因子IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ和TNF-α含量,減輕腸上皮細(xì)胞的凋亡,降低NK細(xì)胞活性,增加抗炎因子IL-10和TGF-β的含量,并增加調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平。對移植術(shù)后7 d各組移植腸道的組織分析發(fā)現(xiàn),CXCR3和HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs能夠更明顯的抑制p38-MAPK蛋白的磷酸化和p38-MAPK通路下游分子ATF2、CHOP10和MEF2C的磷酸化,而更明顯的促進(jìn)PCNA和ZO-1的表達(dá)。結(jié)論:全骨髓貼壁篩選法能夠成功培養(yǎng)出符合實(shí)驗(yàn)需要的BMMSCs。以腺病毒攜帶不同目的基因轉(zhuǎn)染BMMSCs的方法是可行的。CXCR3和HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs比HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs和BMMSCs能更明顯的延緩急性排斥反應(yīng)的發(fā)生、修復(fù)受損的腸道的結(jié)構(gòu)和功能及延長受體的生存時(shí)間。同時(shí)發(fā)現(xiàn)p38-MAPK信號通路參與了此保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R656.7
【部分圖文】：

圖 1-1. BMMSCs 的形態(tài)學(xué)特征（100×）A：原代干細(xì)胞貼壁后的形態(tài)（72h）；B：二代干細(xì)胞；C：三代干細(xì)胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的體外分化結(jié)果第 3 代狀態(tài)良好的 BMMSCs 成骨誘導(dǎo)分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色試劑盒染色后發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的 BMMSCs 胞質(zhì)中有大量的黑色團(tuán)塊狀物質(zhì)沉積，有的呈現(xiàn)小的黑色顆粒狀，此為陽性表現(xiàn)，其余胞質(zhì)為粉色，胞核為紅色（圖1-2 B）；而未進(jìn)行誘導(dǎo)的 BMMSCs 胞質(zhì)沒有出現(xiàn)黑色物質(zhì)沉積（圖 1-2 A）；證實(shí) BMMSCs 能夠誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。BMMSCs 成脂誘導(dǎo)分化 7 d 后，未進(jìn)行油紅O 染色前，顯微鏡下可見胞質(zhì)中有透明的滴狀物質(zhì)，進(jìn)行油紅 O 染色后可見透明的滴狀物質(zhì)被染成橘紅色，此為脂滴（圖 1-2 C）；而未誘導(dǎo)的 BMMSCs 胞質(zhì)中沒有出現(xiàn)橘紅色脂滴（圖 1-2 A）。提示，體外提取到的 BMMSCs 能夠成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞，BMMSCs 具有多向分化潛能。

圖 1-1. BMMSCs 的形態(tài)學(xué)特征（100×）A：原代干細(xì)胞貼壁后的形態(tài)（72h）；B：二代干細(xì)胞；C：三代干細(xì)胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的體外分化結(jié)果第 3 代狀態(tài)良好的 BMMSCs 成骨誘導(dǎo)分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色試劑盒染色后發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的 BMMSCs 胞質(zhì)中有大量的黑色團(tuán)塊狀物質(zhì)沉積，有的呈現(xiàn)小的黑色顆粒狀，此為陽性表現(xiàn)，其余胞質(zhì)為粉色，胞核為紅色（圖1-2 B）；而未進(jìn)行誘導(dǎo)的 BMMSCs 胞質(zhì)沒有出現(xiàn)黑色物質(zhì)沉積（圖 1-2 A）；證實(shí) BMMSCs 能夠誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。BMMSCs 成脂誘導(dǎo)分化 7 d 后，未進(jìn)行油紅O 染色前，顯微鏡下可見胞質(zhì)中有透明的滴狀物質(zhì)，進(jìn)行油紅 O 染色后可見透明的滴狀物質(zhì)被染成橘紅色，此為脂滴（圖 1-2 C）；而未誘導(dǎo)的 BMMSCs 胞質(zhì)中沒有出現(xiàn)橘紅色脂滴（圖 1-2 A）。提示，體外提取到的 BMMSCs 能夠成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞，BMMSCs 具有多向分化潛能。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、BMMSCs 的提取及基因轉(zhuǎn)染 BMMSCs 的制備細(xì)胞流式術(shù)檢測顯示：第 3 代 BMMSCs 中有 99.8 %的 BMMSCs 表達(dá)表面分子 CD29，99.6 %的 BMMSCs 表達(dá)表面分子 CD90，100 %的 BMMSCs 表達(dá) MHCⅠ類抗原 RT1A，而所有的 BMMSCs 基本不表達(dá) CD34、CD45 和 RT1B（MHCⅡ類抗原）（圖 1-3）。
【參考文獻(xiàn)】

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1 李元新;;小腸移植的關(guān)鍵外科技術(shù)[J];器官移植;2012年03期

2 賈柳;侯桂英;葉明;于凱江;;1例心臟移植術(shù)后存活18年危重患者的救治體會[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2011年07期

3 甘樹杰;金濤;丁國善;傅志仁;;趨化因子IP10及其受體CXCR3早期診斷肝移植術(shù)后急性排異[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年01期

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本文編號：2876542