目的:探討趨化因子受體CXCR3(CXC subfamily chemokine receptor 3,CXCR3)和血紅素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)基因聯(lián)合修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)在減輕小腸移植排斥反應和修復移植小腸功能的作用及其作用機制。方法:1.采用SPF級的健康的雄性Lewis大鼠,提取股骨和脛骨骨髓,使用全骨髓貼壁篩選法制備BMMSCs,并通過對BMMSCs的生長形態(tài)、分化能力和表面標記進行鑒定。2.將載有不同目的基因的腺病毒轉(zhuǎn)導進BMMSCs,制備腺病毒空載的BMMSCs(Ad/BMMSCs)、載有HO-1基因的BMMSCs(Ad-HO-1/BMMSCs)、載有CXCR3基因的BMMSCs(Ad-CXCR3/BMMSCs)和載有CXCR3以及HO-1基因的BMMSCs(Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs)。3.使用TNF-α處理大鼠腸上皮細胞(IEC-6),制備腸上皮損傷模型;將損傷的IEC-6細胞與不同的BMMSCs以及正常淋巴細胞共同培養(yǎng);通過結晶紫染色法和活細胞工作站法檢測不同BMMSCs的趨化能力,Western blot、RT-PCR和免疫組化技術檢測p38-MAPK通路的相關分子的表達情況,細胞流式術和ELISA方法檢測T淋巴細胞活性。4.以Brown Norway大鼠為實驗供體,Lewis大鼠為實驗受體,建立異位大鼠小腸移植排斥反應模型。術前給予預處理,在術后0 h、1 d、3 d、7 d、10 d和14 d搜集各組的標本。觀察大鼠的生存狀態(tài)以及生存時間并做生存率分析。通過蘇木素-伊紅染色分析腸道的排斥和損傷情況,Western blot、RT-PCR和免疫組化技術檢測小腸組織中HO-1、CXCR3以及p38-MAPK通路的相關分子的表達情況,基因芯片篩選差異基因。通過細胞流式術檢測脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的水平,乳酸脫氫酶法檢測全血NK細胞活性,ELISA方法檢測各組血清中促炎和抗炎因子以及二胺氧化酶的含量。結果:1.采用全骨髓貼壁篩選法可以成功獲得BMMSCs。獲得的Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs生物學特性與BMMSCs相比均未有改變。2.IEC-6能夠在體外成功建立腸道細胞損傷模型;以BN大鼠為供體,Lewis大鼠為受體能夠建立穩(wěn)定的小腸移植急性排斥反應模型。3.基因芯片篩選出的差異基因與p38-MAPK信號通路相關。4.Western blot、RT-PCR和免疫組化技術檢測可發(fā)現(xiàn)BMMSCs能夠抑制受損細胞的p38-MAPK蛋白的磷酸化,使得p38-MAPK通路下游分子ATF2、CHOP10和MEF2C的磷酸化被抑制,凋亡減少,PCNA和ZO-1的表達增加。其中Ad-(CXCR3+HO-1)/BMMSCs的作用最顯著,且有CXCR3修飾的BMMSCs降低T淋巴細胞活性更明顯。5.在異基因異位小腸移植排斥反應模型中,給以CXCR3和HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs治療能夠更明顯的延長受體大鼠的生存時間;且能夠更明顯的降低促炎因子IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、IFN-γ和TNF-α含量,減輕腸上皮細胞的凋亡,降低NK細胞活性,增加抗炎因子IL-10和TGF-β的含量,并增加調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的水平。對移植術后7 d各組移植腸道的組織分析發(fā)現(xiàn),CXCR3和HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs能夠更明顯的抑制p38-MAPK蛋白的磷酸化和p38-MAPK通路下游分子ATF2、CHOP10和MEF2C的磷酸化,而更明顯的促進PCNA和ZO-1的表達。結論:全骨髓貼壁篩選法能夠成功培養(yǎng)出符合實驗需要的BMMSCs。以腺病毒攜帶不同目的基因轉(zhuǎn)染BMMSCs的方法是可行的。CXCR3和HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs比HO-1基因聯(lián)合修飾的BMMSCs和BMMSCs能更明顯的延緩急性排斥反應的發(fā)生、修復受損的腸道的結構和功能及延長受體的生存時間。同時發(fā)現(xiàn)p38-MAPK信號通路參與了此保護作用。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R656.7
【部分圖文】：

圖 1-1. BMMSCs 的形態(tài)學特征（100×）A：原代干細胞貼壁后的形態(tài)（72h）；B：二代干細胞；C：三代干細胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的體外分化結果第 3 代狀態(tài)良好的 BMMSCs 成骨誘導分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色試劑盒染色后發(fā)現(xiàn)，進行成骨誘導的 BMMSCs 胞質(zhì)中有大量的黑色團塊狀物質(zhì)沉積，有的呈現(xiàn)小的黑色顆粒狀，此為陽性表現(xiàn)，其余胞質(zhì)為粉色，胞核為紅色（圖1-2 B）；而未進行誘導的 BMMSCs 胞質(zhì)沒有出現(xiàn)黑色物質(zhì)沉積（圖 1-2 A）；證實 BMMSCs 能夠誘導為成骨細胞。BMMSCs 成脂誘導分化 7 d 后，未進行油紅O 染色前，顯微鏡下可見胞質(zhì)中有透明的滴狀物質(zhì)，進行油紅 O 染色后可見透明的滴狀物質(zhì)被染成橘紅色，此為脂滴（圖 1-2 C）；而未誘導的 BMMSCs 胞質(zhì)中沒有出現(xiàn)橘紅色脂滴（圖 1-2 A）。提示，體外提取到的 BMMSCs 能夠成功誘導分化為成骨細胞和成脂肪細胞，BMMSCs 具有多向分化潛能。

圖 1-1. BMMSCs 的形態(tài)學特征（100×）A：原代干細胞貼壁后的形態(tài)（72h）；B：二代干細胞；C：三代干細胞。比例尺=100μm。1.2.1.2 BMMSCs 的體外分化結果第 3 代狀態(tài)良好的 BMMSCs 成骨誘導分化 14 d 后，用 Von Kossa 染色試劑盒染色后發(fā)現(xiàn)，進行成骨誘導的 BMMSCs 胞質(zhì)中有大量的黑色團塊狀物質(zhì)沉積，有的呈現(xiàn)小的黑色顆粒狀，此為陽性表現(xiàn)，其余胞質(zhì)為粉色，胞核為紅色（圖1-2 B）；而未進行誘導的 BMMSCs 胞質(zhì)沒有出現(xiàn)黑色物質(zhì)沉積（圖 1-2 A）；證實 BMMSCs 能夠誘導為成骨細胞。BMMSCs 成脂誘導分化 7 d 后，未進行油紅O 染色前，顯微鏡下可見胞質(zhì)中有透明的滴狀物質(zhì)，進行油紅 O 染色后可見透明的滴狀物質(zhì)被染成橘紅色，此為脂滴（圖 1-2 C）；而未誘導的 BMMSCs 胞質(zhì)中沒有出現(xiàn)橘紅色脂滴（圖 1-2 A）。提示，體外提取到的 BMMSCs 能夠成功誘導分化為成骨細胞和成脂肪細胞，BMMSCs 具有多向分化潛能。

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、BMMSCs 的提取及基因轉(zhuǎn)染 BMMSCs 的制備細胞流式術檢測顯示：第 3 代 BMMSCs 中有 99.8 %的 BMMSCs 表達表面分子 CD29，99.6 %的 BMMSCs 表達表面分子 CD90，100 %的 BMMSCs 表達 MHCⅠ類抗原 RT1A，而所有的 BMMSCs 基本不表達 CD34、CD45 和 RT1B（MHCⅡ類抗原）（圖 1-3）。
【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 李元新;;小腸移植的關鍵外科技術[J];器官移植;2012年03期

2 賈柳;侯桂英;葉明;于凱江;;1例心臟移植術后存活18年危重患者的救治體會[J];中國危重病急救醫(yī)學;2011年07期

3 甘樹杰;金濤;丁國善;傅志仁;;趨化因子IP10及其受體CXCR3早期診斷肝移植術后急性排異[J];同濟大學學報(醫(yī)學版);2007年01期

4 鄭紅;趨化因子及其受體的功能[J];免疫學雜志;2004年01期

本文編號：2876542