皮膚是保護(hù)人體免受外界刺激、外界損傷的第一道屏障,臨床上由各種急、慢性致傷因素導(dǎo)致的皮膚損傷十分常見。皮膚創(chuàng)面的愈合是一個復(fù)雜的動態(tài)過程,主要涉及炎癥、增殖和重塑三個重疊階段,嚴(yán)重創(chuàng)傷愈合后往往導(dǎo)致局部組織膠原過度沉積和纖維化,形成增生性瘢痕,嚴(yán)重影響患者的心理健康和生理功能,因此各種創(chuàng)傷所致的創(chuàng)面修復(fù)仍是一個嚴(yán)峻的醫(yī)學(xué)和社會問題。近年來,一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)參與多種生物學(xué)功能的小非編碼RNA—microRNA被發(fā)現(xiàn),它們在創(chuàng)面愈合中的調(diào)控作用也被逐漸發(fā)現(xiàn)和重視。大量研究發(fā)現(xiàn),皮膚創(chuàng)面愈合過程中多種miRNAs差異表達(dá),某些miRNAs參與了創(chuàng)面愈合中炎癥、增殖、重塑三個復(fù)雜動態(tài)修復(fù)過程。據(jù)研究報道,miR-203和miR-210可通過介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移進(jìn)而誘導(dǎo)創(chuàng)面愈合,而miR-99和miR-200家族則可通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞遷移來抑制創(chuàng)面愈合。其他研究還發(fā)現(xiàn),與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的癌癥相關(guān)miRNA—miR-21在皮膚創(chuàng)傷組織中表達(dá)水平顯著上調(diào),抑制miR-21表達(dá)可顯著抑制創(chuàng)面愈合和膠原沉積,而過表達(dá)miR-21則促進(jìn)了創(chuàng)面愈合。同時,大量研究已證實miR-21在肺、腎和肝臟等多種組織臟器中具有促進(jìn)組織纖維化作用,且在增生性皮膚瘢痕中也呈高表達(dá)狀態(tài),表明miR-21可能是一種創(chuàng)傷后促進(jìn)創(chuàng)面愈合的應(yīng)激保護(hù)分子。此外,已有研究證實,miR-21也能夠調(diào)節(jié)外周血中樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的分化和功能,而樹突狀細(xì)胞在傷口修復(fù)中也起著非常重要的作用,增加DCs的數(shù)量可顯著促進(jìn)創(chuàng)面的愈合,而減少DCs的數(shù)量則表現(xiàn)為創(chuàng)面愈合延遲。因此,我們推測:創(chuàng)面組織中過表達(dá)miR-21會不會通過增加創(chuàng)傷組織中DCs含量進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合?本研究擬采用過表達(dá)miR-21模擬物或抑制劑的慢病毒感染SD大鼠皮膚創(chuàng)面組織來調(diào)控創(chuàng)面局部miR-21表達(dá)水平,在體內(nèi)觀察miR-21對創(chuàng)面組織中DCs細(xì)胞含量、創(chuàng)面愈合及相關(guān)指標(biāo)和信號通路PTEN/PI3K/AKT的影響,并通過體外細(xì)胞模型進(jìn)一步研究進(jìn)行驗證miR-21對DCs分化和角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的影響,以探討miR-21在創(chuàng)面愈合中的作用及潛在分子作用機制。第一部分大鼠創(chuàng)面組織中miR-21及相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)研究方法取25只清潔級雄性SD大鼠室內(nèi)適應(yīng)飼養(yǎng)7d,經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(350 mg/kg)對其進(jìn)行麻醉,然后固定于手術(shù)臺上,對背部7 cm×3 cm大小區(qū)域進(jìn)行脫毛處理,碘伏酒精消毒后,用無菌手術(shù)刀制作4 cm~2的全層皮膚缺損創(chuàng)面,全層切開皮膚,開放創(chuàng)面,深達(dá)肌肉,充分止血,創(chuàng)面以無菌紗布覆蓋,外用醫(yī)用膠布固定,自由進(jìn)食飲水。于造模后即刻、第6h、24h、48h、72h隨機抽取5只SD大鼠,取各大鼠創(chuàng)面滲出液,檢測其細(xì)胞含量,并取創(chuàng)面組織進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān)檢測。結(jié)果創(chuàng)面損傷模型建立后,分別于0h、6h、24h、48h、72h時檢測創(chuàng)傷組織中miR-21表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)均顯著上調(diào),且于24h時表達(dá)達(dá)到最大值;基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9,MMP-9)的表達(dá)與miR-21趨勢相同,在創(chuàng)傷形成后6h內(nèi)顯著增加,并于24h達(dá)到最大值。傷口形成后72h內(nèi),傷口滲出液中細(xì)胞總數(shù)也明顯增加,同時CD11c+CD209+DCs的含量也隨之顯著增加。進(jìn)一步分析表明,miR-21的表達(dá)與MMP-9的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.9027),同樣也與CD11c+CD209+DCs的含量呈顯著正相關(guān)(r=0.9348)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),傷口形成后72h內(nèi),第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)蛋白表達(dá)顯著降低,磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B,p-Akt)p-AKT蛋白表達(dá)顯著增加,而總的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)無明顯變化。結(jié)論創(chuàng)傷形成后,創(chuàng)面組織中miR-21、MMP-9、p-AKT表達(dá)以及創(chuàng)面滲出液中細(xì)胞總數(shù)和CD11c+CD209+DCs含量均顯著增加,并于24h時均達(dá)到最大值,而創(chuàng)傷組織中PTEN表達(dá)顯著降低,并于24h時達(dá)到最小值。MiR-21的表達(dá)與MMP-9的表達(dá)和CD11c+CD209+DCs的含量呈顯著正相關(guān)。第二部分MiR-21對皮膚創(chuàng)面愈合的影響研究方法將過表達(dá)和抑制miR-21表達(dá)的慢病毒載體(LV-miR-21 mimic和LV-miR-21 inhibitor)與包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中包裝慢病毒。取160只清潔級雄性SD大鼠,按照第一部分方法制備創(chuàng)面損傷SD大鼠模型,并隨機分為4組:control組、LV-NC組、LV-miR-21 mimic組和LV-miR-21 inhibitor組,每組40只,其中control組創(chuàng)面局部注射5μl生理鹽水,其他各組分別注射對應(yīng)的慢病毒5μl。造模后分別于第1、3、5、7、9、11、13、15天,利用透明薄膜覆蓋大鼠創(chuàng)面,數(shù)碼相機拍照后用圖像分析軟件Image-proplus6.0對創(chuàng)面面積進(jìn)行統(tǒng)計分析處理,計算公式為:創(chuàng)面殘留率=殘余創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積×100%;qRT-PCR檢測創(chuàng)面組織中miR-21和PTEN mRNA變化;流式細(xì)胞儀檢測創(chuàng)口滲出液中CD11c+CD209+DCs的含量;Western blot檢測創(chuàng)面組織中PTEN、p-AKT、AKT以及MMP-9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與control組和LV-NC組相比,LV-miR-21 mimic組創(chuàng)傷組織中miR-21的表達(dá)明顯上調(diào),而LV-miR-21 inhibitor組中miR-21表達(dá)則顯著被抑制。與control組相比,LV-miR-21 mimic能夠明顯改善大鼠皮膚創(chuàng)面愈合,而LV-miR-21inhibitor則顯著延緩創(chuàng)面愈合進(jìn)程。CD11c+CD209+DCs的含量隨miR-21表達(dá)的增加而增加,隨miR-21表達(dá)的降低而降低。創(chuàng)傷形成后3天,LV-miR-21 mimic可在mRNA和蛋白水平上抑制PTEN的表達(dá),相反LV-miR-21 inhibitor則可促進(jìn)PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)。過表達(dá)miR-21也可在蛋白水平上顯著上調(diào)p-AKT和MMP-9的表達(dá);相比之下,抑制miR-21則可使p-AKT和MMP-9的蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論過表達(dá)miR-21能夠明顯縮短大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合時間,誘導(dǎo)創(chuàng)面組織中CD11c+CD209+DCs的含量及p-AKT和MMP-9的表達(dá)增加,抑制創(chuàng)面組織中PTEN表達(dá);相反,抑制miR-21則可顯著延緩創(chuàng)面愈合進(jìn)程,降低創(chuàng)面組織中CD11c+CD209+DCs的含量及p-AKT和MMP-9的表達(dá),促進(jìn)創(chuàng)面組織中PTEN表達(dá)。上述結(jié)果表明,增加miR-21的表達(dá)可促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合,反之則會延緩創(chuàng)面的愈合。第三部分MiR-21通過改變DCs含量影響創(chuàng)面的愈合研究方法取60只清潔級雄性SD大鼠,按照第一部分方法制備創(chuàng)面損傷SD大鼠模型,并隨機分為4組:control組、FL(fms-like tyrosine kinase-3 ligand,FMS樣酪氨酸激酶-3配體)組、LV-miR-21 inhibitor組和LV-miR-21 inhibitor+FL組,每組15只,其中control組創(chuàng)面局部注射5μl生理鹽水,LV-miR-21 inhibitor組和LV-miR-21 inhibitor+FL組創(chuàng)面局部注射LV-miR-21 inhibitor慢病毒5μl,FL組和LV-miR-21 inhibitor+FL組于創(chuàng)傷部位周圍真皮組織注射FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)來刺激DCs分化,每日注射10μg,連續(xù)注射4天。造模后分別于第1、3、5天,利用透明薄膜覆蓋大鼠創(chuàng)面,數(shù)碼相機拍照后用圖像分析軟件Image-proplus6.0對創(chuàng)面面積進(jìn)行統(tǒng)計分析處理,計算公式為:創(chuàng)面殘留率=殘余創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積×100%;qRT-PCR檢測創(chuàng)面組織中miR-21和PTEN mRNA變化;流式細(xì)胞儀檢測創(chuàng)口滲出液中CD11c+CD209+DCs的含量;Western blot檢測創(chuàng)面組織中PTEN、p-AKT、AKT以及MMP-9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果創(chuàng)面形成后1、3、5天分別檢測創(chuàng)面殘留率,發(fā)現(xiàn)LV-miR-21 inhibitor組創(chuàng)面愈合明顯減緩,而應(yīng)用FL組則顯著促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合,并逆轉(zhuǎn)LV-miR-21inhibitor對傷口愈合的抑制作用。應(yīng)用FL可誘導(dǎo)創(chuàng)面組織中CD11c+CD209+DCs含量增加,并促進(jìn)miR-21、p-AKT和MMP-9的表達(dá)以及抑制PTEN的表達(dá)。此外,LV-miR-21 inhibitor對CD11c+CD209+DCs含量及miR-21、p-AKT、MMP-9、PTEN表達(dá)的影響可被FL部分逆轉(zhuǎn)。結(jié)論MiR-21 inhibitor顯著延緩了創(chuàng)面愈合,降低了創(chuàng)面滲出液中DCs含量,抑制了p-AKT、MMP-9表達(dá)及促進(jìn)PTEN表達(dá),而FL則逆轉(zhuǎn)了miR-21 inhibitor的作用,表明miR-21可能通過增加創(chuàng)面組織中DCs的含量促進(jìn)創(chuàng)面愈合。第四部分MiR-21對DCs分化的影響研究方法用淋巴細(xì)胞分離液分離大鼠外周血單個核細(xì)胞(PBMCs),將分離得到的PBMCs在含有10%FBS和1%鏈霉素青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37°C、5%CO_2的加濕保溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將miR-21模擬物/抑制劑或miR-NC轉(zhuǎn)染至PBMCs中,后用重組大鼠GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)5天。流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后PBMCs中CD11c+CD209+DCs的含量;qRT-PCR檢測PBMCs中miR-21、PTEN和MMP9的表達(dá)變化;ELISA法檢測PBMCs上清液中MMP-9的分泌;Western blot檢測PTEN、p-AKT、AKT和MMP-9蛋白表達(dá)。結(jié)果過表達(dá)miR-21顯著促進(jìn)了PBMCs中DCs的分化,而miR-21 inhibitor抑制了DCs的分化。另外miR-21 inhibitor顯著上調(diào)PTEN mRNA和蛋白表達(dá),而過表達(dá)miR-21則明顯抑制了PTEN的表達(dá)。MiR-21 inhibitor可抑制MMP-9的分泌和p-AKT表達(dá),miR-21模擬物的作用則與之相反。結(jié)論過表達(dá)miR-21能夠促進(jìn)PBMCs中DCs的分化,抑制PTEN表達(dá)并促進(jìn)p-AKT和MPP-9的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞上清培養(yǎng)液中MMP-9分泌增加。第五部分PTEN通過PI3K/AKT信號通路對DCs分化的影響研究方法用淋巴細(xì)胞分離液分離大鼠外周血單個核細(xì)胞(PBMCs),將分離得到的PBMCs在含有10%FBS和1%鏈霉素青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37°C、5%CO_2的加濕保溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將PTEN干擾RNA—si-PTEN轉(zhuǎn)染至PBMCs中,聯(lián)合或不聯(lián)合PI3K/AKT抑制劑LY 294002處理,后用重組大鼠GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)5天。流式細(xì)胞儀檢測誘導(dǎo)后PBMCs中CD11c+CD209+DCs的含量;ELISA實驗檢測PBMCs上清液中MMP-9的分泌量;Western blot檢測p-AKT和AKT的蛋白表達(dá)。結(jié)果PTEN基因敲除能有效地促進(jìn)PBMCs中DCs的分化和MMP-9的分泌及p-AKT的蛋白表達(dá),而PI3K/AKT抑制劑LY 294002則能明顯減輕si-PTEN誘導(dǎo)的DCs含量、MMP-9分泌和p-AKT的蛋白表達(dá)。結(jié)論PTEN能夠通過PI3K/AKT信號通路抑制PBMCs中DCs的分化和細(xì)胞上清培養(yǎng)液中MMP-9的分泌。第六部分MiR-21通過調(diào)節(jié)PTEN促進(jìn)DCs分化進(jìn)而影響角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移研究方法利用TargetScan在線生物信息學(xué)分析網(wǎng)站和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-21與PTEN之間的靶向調(diào)控關(guān)系。用淋巴細(xì)胞分離液分離大鼠外周血單個核細(xì)胞(PBMCs),將分離得到的PBMCs在含有10%FBS和1%鏈霉素青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37°C、5%CO_2的加濕保溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將miR-21 inhibitor和/或si-PTEN轉(zhuǎn)染至PBMCs中,用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)5d。ELISA實驗檢測PBMCs上清液中MMP-9的分泌量;用轉(zhuǎn)染PBMCs的上清液培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞,劃痕實驗檢測角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移變化。結(jié)果TargetScan在線生物信息學(xué)分析顯示miR-21和PTEN中存在互補結(jié)合的核苷酸序列。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?轉(zhuǎn)染miR-21 mimic可顯著抑制PTEN的熒光素酶活性。用轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor的細(xì)胞上清液培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞后細(xì)胞的遷移能力顯著降低,而沉默PTEN則逆轉(zhuǎn)了miR-21 inhibitor對角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的抑制作用。進(jìn)一步研究證實,轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor能夠降低PBMCs上清液中MMP-9的含量,而這種下調(diào)作用可被沉默PTEN所逆轉(zhuǎn)。結(jié)論MiR-21能夠通過靶向調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)促進(jìn)DCs的分化進(jìn)而影響角質(zhì)細(xì)胞的遷移。綜上所述,miR-21對創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用可能是通過抑制PTEN激活PI3K/AKT信號通路增加DCs的含量而實現(xiàn)的。MIR-21對創(chuàng)面愈合有著深遠(yuǎn)的影響,本研究為旨在通過調(diào)節(jié)miR-21增加DCs含量而促進(jìn)創(chuàng)面愈合的新治療策略應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R641
【部分圖文】：

法 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差符合正態(tài)分布，兩組數(shù)據(jù)比較用獨立樣本 t 檢驗，差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果組織中 miR-21 的表達(dá) 可以看出，創(chuàng)傷模型建立后 0h、6h、24h、48h、72中 miR-21 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與 0h 相比，其他各個時間點于 24h 時達(dá)到最大值，差異顯著（P<0.01）。

間點創(chuàng)面組織滲出液中總細(xì)胞數(shù)的變化；注：與 0h 組umber in wound fluids at different time points; **P< 0. 01group織滲出液中 CD11c+CD209+ DCs 含量變化1.3 所示，創(chuàng)傷模型建立后 0h、6h、24h、48h、滲出液中 CD11c+ CD209+ DCs 含量變化，發(fā)現(xiàn)組織滲出液中 CD11c+ CD209+ DCs 數(shù)量均顯著進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面組織中 miR-21 表達(dá)與創(chuàng)9+ DCs 的數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.9348），差異具

點創(chuàng)面組織滲出液中 CD11c+ CD209+ DCs 含量變化；注**P<0.01entage of CD11c+ CD209+ DCs in wound fluids at differen0. 01, compared with 0h group組織中 MMP-9 mRNA 表達(dá)變化 1.4 所示，創(chuàng)傷模型建立后 0h、6h、24h、48h、中 MMP-9 mRNA 表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)與 0h 相比，其P-9 mRNA 表達(dá)均顯著增加，且于 24h 時達(dá)到最織中 miR-21 表達(dá)與 MMP-9 的表達(dá)呈正相關(guān)(r=（P<0.05）。
【參考文獻(xiàn)】

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