研究背景:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一種常見的神經(jīng)急危重癥,具有高致死率和高致殘率。早期腦損傷(early brain injury,EBI),即SAH后最初的72小時內(nèi)發(fā)生的腦損傷,是造成SAH患者急性期死亡和后期神經(jīng)功能障礙的重要因素。其病理生理機制復雜,炎癥反應在其中發(fā)揮了重要的作用。近來的研究表明 NLRP3(NACHT,LRR and PYD domains containing protein 3,)炎性小體在EBI的炎性反應中發(fā)揮了重要作用。二氫硫辛酸(dihydrolipoicacid,DHLA)是一種有效的抗氧化分子,它能穩(wěn)定溶酶體膜,減輕氧化應激反應。在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型,包括SAH模型中已經(jīng)證實,DHLA具有神經(jīng)保護功能。然而DHLA的神經(jīng)保護功能的機制尚不明確。在本項研究中,我們探究DHLA對溶酶體破裂和NLRP3炎性小體激活的作用,并探究其中的信號通路。研究方法:建立大鼠SAH血管內(nèi)穿刺模型,術后1小時腹腔注射DHLA,術前48小時腦室內(nèi)注射溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP1)小干擾RNA、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)小干擾RNA。通過SAH出血量評分,改良Garcia評分,平衡木實驗,水迷宮實驗,Rotarod實驗來評估大鼠SAH后短期和長期神經(jīng)功能。應用Western blot技術測定LAMP1、CaMKⅡ、轉化生長因子激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)、c-JunN-末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)、NLRP3、cleaved caspase-1、白細胞介素(interleukin,IL)-1β等相關蛋白的表達,用共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光下相關蛋白和神經(jīng)細胞的共染。結果:SAH后LAMP1的表達降低,在24小時達到最低水平。磷酸化的CaMKⅡα(p-CaMKⅡα)在SAH后表達增加,在24小時達到高峰。LAMP1與CaMKⅡα都能在神經(jīng)元和小膠質細胞上表達。DHLA治療增加了 LAMP1的表達,降低了p-CaMKⅡa的表達,并緩解了 SAH后短期以及長期的神經(jīng)功能損害。LAMP1小干擾RNA破壞了 DHLA的神經(jīng)功能保護作用,并且增加了 p-CaMKⅡα、p-TAK1、p-J-NK和NLRP3炎性小體的表達。CaMKⅡα小干擾RNA下調(diào)了 p-TAK1、p-JNK和NLRP3炎性小體的表達并改善了 SAH后的神經(jīng)功能。結論:DHLA治療能通過LAMP1/CaMKⅡ/TAK1信號通路減輕SAH后早期腦損傷的炎癥損傷,改善神經(jīng)功能。DHLA也許能為緩解SAH后早期腦損傷提供一種有前景的治療方法。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R743.35;R651.15
【部分圖文】：

ＮＬＲＰ３的表達增加；（２）?ＤＨＬＡ可以穩(wěn)定溶酶體膜，增加ＬＡＭＰ１表迖，降低??ＣａＭＫＩＩ及ＮＬＲＰ３炎性小體的表達，并改善神經(jīng)功能；（３）?ＤＨＬＡ的抗炎性作用??通過ＬＡＭＰｌ／ＣａＭＫＩＩ／ＴＡＫｌ信號通路的調(diào)控（圖１．１）。??Ｓ?ＳＡＨ??—ｖ?：????溶酶體破裂?Ｃ：??ＬＡＭＰ１?＜——二氫硫辛酸（ＤＨＬＡ）??丄??＼?ＣａＭＫＩＩ??Ｉ??Ｐ??ＴＡＫ１?｜｜?Ｐｒｏ－ＩＬ－ｌｐ??ｆ?？?ｆ?Ｆｒｏ－ＩＬ－１８?????Ｐ＇?ＪＮＫ??＞?＾?炎性反應??、ＩＬ－１Ｐ????，?ＩＬ－１８??＜?促進?Ｃａｓｐａｓｅｌ??１?抑制?ＮＬＲＰ３炎性小體??圖１．１二氫硫辛酸在蛛網(wǎng)膜下腔出血后穩(wěn)定溶酶體膜，抑制炎性反應的機??制。??３??

圖１．２?Ｓｕｇａｗａｒａ?ＳＡＨ出血評分法［ｕ〗。??．４神經(jīng)功能評分??神經(jīng)功能評分是采用雙盲的方法。采用改良的神經(jīng)功能缺損評分（Ｇａｃｉａ評分）??實驗動物２４小時后神經(jīng)功能缺損狀況［１１］。改良的Ｇａｃｉａ評分包括自主運動、??活動、前肢伸展、攀爬活動、本體感覺和觸須刺激六項，評分范圍０？３??總分為３？１８分（表Ｕ）。??

第一部分實驗共使用大鼠４４只，ｓｈａｍ組６只，ＳＡＨ組３８只。其中ｓｈａｍ組??死亡０只，ＳＡＨ組死亡５只，死亡率為１３．２％。因ＳＡＨ評分低于９分，排除１??只。各ＳＡＨ組的ＳＡＨ評分沒有顯著差異，提示模型制作穩(wěn)定（圖１．３）。??ｗ??Ｓｈａｍ?ＳＡＨ??Ｂ?Ｃ?１８??Ｇｒｏｕｐｓ?Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ?Ｅｘｃｌｕｄｅｄ?１５＇?〇９?°??Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ?１?１２?Ｈ９?ＲＨ??－?°，６?。?Ｌ??ＳＡＨ?（３ｈ；?６ｈ，?１２ｈ，?２４ｈ，?７２ｈ）?５／３８?１?３＇誦?＿?■?＿?＿??Ｔｏｔ＾?５／４４?１?〇?Ｓｈａｍ?３ｈ?６ｈ?１２ｈ?２４ｈ?７２ｈ??ＳＡＨ??圖１．３實驗用鼠的分組、死亡率和ＳＡＨ評分。Ａ：典型的ｓｈａｍ組和ＳＡＨ組??模型圖片；Ｂ：各組實驗用鼠的死亡率和排除率；Ｃ：各組的ＳＡＨ評分。Ｂａｒｓ代??表?ｍｅａｎ士ＳＥＭ；?ｎ＝６〇??１．３．２?ＳＡＨ后ＬＡＭＰ１的表迗及與神經(jīng)細胞的共定位情況??我們用Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ實驗測定ＳＡＨ后３、６、１２、２４和７２小時ＬＡＭＰ１蛋白??的表達水平。結果顯示：ＳＡＨ后３小時ＬＡＭＰ１表達開始降低，到２４小時表達迖??到最低水平，７２小時后開始回升。其中２４小時后的表達跟ｓｈａｍ組比有統(tǒng)計學差??異（Ｐ＜０．０５?圖?１．４）。??１８??
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本文編號：2870640