成骨細胞是骨形成的主要功能細胞之一,成骨細胞的增殖和分化功能受到抑制時,會使骨形成減慢,骨代謝失衡,并最終導致骨質(zhì)疏松。成骨細胞的功能受到多種因素的影響,包括成骨細胞內(nèi)部的表觀和非表觀遺傳學因素,以及細胞外界的一些力學刺激等。但成骨細胞響應力學刺激并啟動內(nèi)部信號通路的機制至今仍不明確。微管微絲交聯(lián)分子(microtubule actin crosslinking factor 1,MACF1)是連接微絲和微管的細胞骨架蛋白,MACF1可以調(diào)控細胞骨架動力學,進而參與力學刺激響應、細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞遷移、以及疾病發(fā)生等生物學過程。本團隊前期研究表明,MACF1在成骨細胞增殖、分化過程中起重要作用。但MACF1對成骨細胞增殖和分化的調(diào)控機制目前尚未明確。因此,本研究目的旨在闡明MACF1對成骨細胞增殖調(diào)控作用及機制;并結(jié)合MACF1相關(guān)非編碼RNA,研究其對對成骨細胞分化的調(diào)控作用。為深入研究力學條件下MACF1的功能和成骨細胞增殖和分化的機制提供了理論和實驗基礎(chǔ),并且也對尋找骨質(zhì)疏松診斷和治療的新靶點具有非常重要的意義。研究方法:本研究首先采用三維隨機回轉(zhuǎn)儀和小鼠尾懸吊后肢去負荷模型,檢測在力學去負荷條件下MACF1在MC3T3-E1小鼠前成骨細胞以及C57BL/6小鼠股骨組織和股骨骨源間充質(zhì)干細胞中的表達變化;采用MACF1高/低表達MC3T3-E1前成骨細胞模型,研究MACF1對成骨細胞堿性磷酸酶活性、細胞礦化結(jié)節(jié)生成、成骨分化相關(guān)基因表達和細胞增殖速率的影響,并結(jié)合力學去負荷條件,檢測MACF1在力學去負荷條件下對β-catenin表達水平和活性的影響,以及β-catenin對成骨細胞增殖的調(diào)控作用。進一步通過對MACF1低表達前成骨細胞進行LncRNA、miRNA、mRNA表達譜基因芯片分析,結(jié)合生物信息學分析手段,篩選MACF1相關(guān)的成骨分化非編碼RNA,并通過CHIP-seq和JASPAR數(shù)據(jù)庫預測MACF1對篩選獲得的非編碼RNA的調(diào)控作用。在老齡和尾懸吊骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨組織中檢測篩選獲得的Lnc-DIF和miR-489-3p的表達變化。在前成骨細胞中轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA或miR-489-3p模擬物/抑制物,檢測細胞的成骨分化標志基因表達水平、堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成速率、以及轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA對前成骨細胞miR-489-3p水平的變化。通過熒光原位雜交技術(shù),檢測Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨細胞中的分布情況。通過熒光素酶報告基因檢測技術(shù),檢測了前成骨細胞中Lnc-DIF對miR-489-3p的結(jié)合作用。使用成骨細胞靶向遞送系統(tǒng)在去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型中轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA,通過microCT技術(shù)檢測小鼠骨微結(jié)構(gòu)的變化。檢測轉(zhuǎn)染AK016739-siRNA后,前成骨細胞的堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)生成速率、以及成骨分化標志基因和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子水平的表達水平。并分別采用超景深顯微鏡、鈣黃綠素標記、免疫組化和RT-PCR方法檢測去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠轉(zhuǎn)染AK016739-siRNA后的顱骨厚度、骨形成速率、成骨標志因子蛋白水平和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達變化。研究結(jié)果:(1)MACF1參與成骨細胞對力學條件的響應,調(diào)控成骨細胞功能在三維隨機回轉(zhuǎn)力學去負荷條件處理24和48 h后,小鼠前成骨細胞MC3T3-E1中MACF1的mRNA和蛋白表達水平均降低;在28天的尾懸吊力學去負荷處理后,小鼠股骨組織中MACF1的mRNA和蛋白水平,以及股骨骨源間充質(zhì)干細胞中MACF1的mRNA水平也明顯下調(diào)。在MACF1高/低表達前成骨細胞中,細胞的堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)生成和成骨分化相關(guān)基因表達均受到MACF1的正調(diào)控,同時細胞的增殖速率和增殖細胞比率也受到MACF1的正調(diào)控。力學去負荷條件對成骨細胞增殖的抑制作用受到了MACF1表達水平的影響:MACF1低表達時力學去負荷條件對成骨細胞的增殖抑制作用較弱。此外,結(jié)果顯示在MACF1高/低表達前成骨細胞中,β-catenin的mRNA與蛋白表達和β-catenin的活性也受到了MACF1的正調(diào)控;并且力學去負荷條件抑制β-catenin的mRNA表達的作用也在MACF1低表達時減弱。以siRNA干擾β-catenin表達可以抑制成骨細胞增殖,而氯化鋰處理則對上述過程有恢復效果。綜合分析以上結(jié)果,表明:力學去負荷條件抑制成骨細胞中的MACF1表達;MACF1參與成骨細胞響應力學去負荷條件,且正調(diào)控成骨細胞的增殖和分化;此外,MACF1對成骨細胞增殖的調(diào)控,通過β-catenin信號通路實現(xiàn)。(2)MACF1相關(guān)非編碼RNA——Lnc-DIF及mir-489-3p的篩選及其對成骨細胞分化和骨形成的調(diào)控作用MACF1低表達前成骨細胞的lncRNA、miRNA、mRNA表達譜芯片的生物信息學分析結(jié)果顯示:miR-489-3p在MACF1低表達成骨細胞中表達降低,且與成骨分化基因相關(guān)性最好,而Lnc-DIF在MACF1低表達成骨細胞中表達升高,且Lnc-DIF序列中存在多個miR-489-3p結(jié)合位點。CHIP-seq和JASPAR數(shù)據(jù)庫預測結(jié)果發(fā)現(xiàn)了MACF1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子在Lnc-DIF啟動子區(qū)域存在結(jié)合位點,說明MACF1可能調(diào)控Lnc-DIF的轉(zhuǎn)錄。因此推測,MACF1通過調(diào)控Lnc-DIF表達,影響miR-489-3p對靶基因—成骨分化相關(guān)基因—的調(diào)控。在老齡和尾懸吊骨質(zhì)疏松小鼠模型的股骨組織中,Lnc-DIF表達升高。在前成骨細胞中轉(zhuǎn)染Lnc-DIF的siRNA可以上調(diào)成骨分化標志基因表達,并且提高細胞堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成水平。熒光原位雜交結(jié)果表明Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨細胞中主要分布在細胞質(zhì)中;轉(zhuǎn)染Lnc-DIF-siRNA可升高前成骨細胞miR-489-3p水平,通過熒光素酶報告基因檢測證明了Lnc-DIF可以結(jié)合miR-489-3p。采用骨靶向遞送系統(tǒng)經(jīng)小鼠尾靜脈注射Lnc-DIF的siRNA可以恢復去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的骨微結(jié)構(gòu)。miR-489-3p在老齡骨質(zhì)疏松患者骨組織、以及老齡和尾懸吊骨質(zhì)疏松小鼠模型股骨組織中低表達。在前成骨細胞中轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染miR-489-3p的模擬物或抑制物,分別促進/抑制成骨細胞分化。綜合分析以上結(jié)果,表明:MACF1可能通過轉(zhuǎn)錄因子負調(diào)控Lnc-DIF,而Lnc-DIF則通過結(jié)合miR-489-3p,抑制成骨細胞分化和骨形成。(3)MACF1相關(guān)長鏈非編碼RNAAK016739的篩選及其對成骨細胞分化和骨形成的調(diào)控作用MACF1低表達前成骨細胞的基因芯片分析結(jié)果顯示,AK016739是與成骨分化基因相關(guān)性最好的長鏈非編碼RNA。采用CHIP-seq和JASPAR數(shù)據(jù)庫預測轉(zhuǎn)錄因子的手段驗證了MACF1對其的調(diào)控作用。在MC3T3-E1前成骨細胞中轉(zhuǎn)染AK016739的siRNA可以提高成骨細胞堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)生成水平,并且促進成骨細胞分化標志基因和成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達。體內(nèi)轉(zhuǎn)染AK016739的siRNA可以恢復去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠的顱骨厚度、骨形成速率、成骨標志因子蛋白水平和成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達水平。綜合分析以上結(jié)果,表明:MACF1可以通過轉(zhuǎn)錄因子負調(diào)控AK016739,而AK016739則可以抑制成骨細胞分化和骨形成。結(jié)論:綜上所述,MACF1在成骨細胞響應力學去負荷條件中扮演重要角色,并且對成骨細胞的增殖和分化功能起正調(diào)控作用。MACF1可以通過β-catenin來促進成骨細胞增殖。此外,還可以通過其下游的非編碼RNA:Lnc-DIF-miR-489-3p軸和AK016739正調(diào)控成骨細胞分化和骨形成。本研究闡明了力學響應分子MACF1對成骨細胞增殖和分化的調(diào)控作用及調(diào)控機制,并且發(fā)現(xiàn)了新的調(diào)控成骨細胞分化的表觀遺傳學信號通路。本研究為闡明成骨細胞對力學去負荷條件的感知以及其對骨形成的影響提供了理論基礎(chǔ),同時也對骨代謝相關(guān)疾病的防治提供了新的潛在治療靶點。
【學位單位】：西北工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：
MACF1的結(jié)構(gòu)
促進β-catenin 的入核以及下游轉(zhuǎn)錄因子 TCF7/LEF1 的活性（圖 1-2）。胡麗年的研究也證明了 MACF1 可以在成骨細胞中調(diào)控β-catenin 的入核和降解，MACF1 可以通過調(diào)控 Wnt/β-catenin 信號通路促進成骨細胞分化[109]。此外，可以調(diào)控高爾基體相關(guān)的蛋白運輸[110, 111]，高爾基體是負責細胞內(nèi)部合成蛋運的細胞器，而研究表明，MACF1 可以調(diào)控高爾基體內(nèi)加工后的蛋白囊泡的反式面轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的微管上的驅(qū)動蛋白，從而調(diào)控細胞內(nèi)蛋白的分配[1MACF1分子上還存在一個GSK-3β的磷酸化位點，這暗示了MACF1可能會調(diào)的功能[101, 112]。
圖 1-3 lncRNA 的功能[152]Fig.1-3 Functions of lncRNAslncRNA 對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可以通過直接與染色體結(jié)合，并調(diào)控基因的組蛋白修飾水平，影響基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，包括 Xist、Tsix 和 Xite 在內(nèi)的多種 lncRNA 都可以通過召集組蛋白 H3K27 甲基化酶復合體或組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的方式使基因失活。研究發(fā)現(xiàn)，Xist（X 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄因子，X-inactive specific transcript）可以在染色體失活中心與 RepA 和 PRC2 形成復合物，并結(jié)合到 lncRNAXist 的啟動子區(qū)，反式激活 Xist 的轉(zhuǎn)錄表達，隨后 Xist 與 PRC2 結(jié)合，并沿 X 染色體移動使 X 染色體失活[153]。此外，lncRNAKcnqlot1 可以通過召集 PRC2 的方式，通過甲基化修飾等方法使目標基因失活[154]。而lncRNA HOTTIP 則可以召集 WDR5/MLL 復合物使 HOXA 位點甲基化，從而激活位點附近基因的表達[155]。此外，lncRNA 對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控除了可以召集并形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合物的方式以外，還可以通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方式調(diào)控基因表達。例如，lncRNAPANDA可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 NF-YA，對促凋亡基因的表達起抑制作用[156]。lncRNA 可以通過調(diào)控 mRNA 的可變剪接來對轉(zhuǎn)錄后的 mRNA 進行調(diào)控。mRNA在轉(zhuǎn)錄后，其前體（pre-mRNA）必須通過可變剪接產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，繼而翻譯成不
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本文編號：
2865419
