目的:戰(zhàn)爭、恐怖襲擊、自然災(zāi)害以及突發(fā)事件的爆炸傷或燒傷等外界突發(fā)強(qiáng)烈刺激引起機(jī)體各系統(tǒng)產(chǎn)生劇烈反應(yīng),在消化道表現(xiàn)為應(yīng)激性潰瘍,發(fā)病率和死亡率均較高;其發(fā)病機(jī)制主要涉及胃黏膜屏障作用的減弱、胃酸及炎癥介質(zhì)過度釋放、細(xì)菌及內(nèi)毒素移位、幽門螺旋桿菌感染、神經(jīng)-內(nèi)分泌軸失衡等方面,但其分子機(jī)制方面尚無巨大突破;有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生與NF-κB激活密切相關(guān),但NF-kB通路如何參與的具體作用機(jī)制尚未闡明。本題組前期在幽門螺桿菌感染相關(guān)microRNAs功能研究中發(fā)現(xiàn)microRNA-146a作為依賴NF-κB生成的內(nèi)源性調(diào)控因子,負(fù)性調(diào)控NF-κB,參與炎癥應(yīng)答。在應(yīng)激性潰瘍中miR-146a是否能調(diào)控NF-kB,以及通過何機(jī)制調(diào)控應(yīng)激性潰瘍還不清楚。本實(shí)驗通過建立應(yīng)激性潰瘍體內(nèi)模型和體外模型,探索應(yīng)激性潰瘍模型標(biāo)本中microRNA-146a的是否過表達(dá);構(gòu)建并鑒定microRNA-146a的靶基因;分析microRNA-146a是否通過目的靶基因發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用,探討microRNA-146a抑制應(yīng)激性潰瘍發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。研究“應(yīng)激性潰瘍發(fā)生、microRNA-146a變化與抑制效應(yīng)”的作用模式和機(jī)制,對進(jìn)一步闡明應(yīng)激性潰瘍的分子發(fā)病機(jī)制具有重要意義,更為研究戰(zhàn)時應(yīng)激性潰瘍的治療和預(yù)防策略提供實(shí)驗室數(shù)據(jù)支持。方法:1、體內(nèi)驗證模型胃黏膜組織中是否存在miR-146a的表達(dá)。采用冷水束縛模型處理小鼠,分別取實(shí)驗組和對照組的胃黏膜做HE染色和Real-time PCR檢測NF-κB p65、microRNA-146a 的表達(dá)。2、體外人胃腺癌AGS細(xì)胞應(yīng)激性潰瘍模型的建立及miR-146a在模型中的表達(dá)。采用200umol/L H2O2處理AGS細(xì)胞6 h,檢測兩組丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及NF-κBp65、microRNA-146a的表達(dá)。3、microRNA-146a在應(yīng)激性潰瘍發(fā)生機(jī)制中負(fù)性調(diào)控作用的研究。結(jié)合生物信息學(xué)庫預(yù)測、雙熒光素酶報告載體實(shí)驗、實(shí)時定量PCR等方法鑒定miRNAs在AGS細(xì)胞中的靶基因;通過體外過表達(dá)或抑制表達(dá)miRNAs、PCR等實(shí)驗深入研究miRNAs在應(yīng)激性潰瘍中調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。結(jié)果:1、體內(nèi)驗證模型胃黏膜組織中是否存在miR-146a的表達(dá)。100倍光學(xué)顯微鏡下,與對照組比較,實(shí)驗組小鼠胃黏膜上皮部分呈現(xiàn)明顯的缺損,表面有炎性滲出物,說明模型建立成功;Real-time PCR結(jié)果顯示實(shí)驗組microRNA-146a的mRNA表達(dá)上升了 4 倍(P0.01)、NF-κBp65 的 mRNA 表達(dá)升高了 2 倍(P0.01)。2、體外人胃腺癌AGS細(xì)胞應(yīng)激性潰瘍模型的建立及miR-146a在模型中的表達(dá)。與對照組比較,實(shí)驗組細(xì)胞內(nèi)MDA的含量明顯增加(P0.01)、SOD活力下降較明顯(P0.01),說明細(xì)胞模型建立穩(wěn)定;microRNA-146a和NF-kBp65的mRNA表達(dá)均明顯升高(P0.01,P0.01)。3、microRNA-146a在應(yīng)激性潰瘍發(fā)生機(jī)制中負(fù)性調(diào)控作用的研究。①microRNA-146a靶基因的預(yù)測和鑒定在TargetScan和Miranda預(yù)測到microRNA-146a 的可疑靶基因 APPL1(Adaptor protein containing PH domain,PTB domain and leucinezipper motif1),構(gòu)建作用靶點(diǎn)熒光素酶報告載體證實(shí)microRNA-146a能與可疑靶基因APPL1 3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合;Real-time PCR結(jié)果表明,micro-146a能降解靶基因APPL1的mRNA從而抑制其翻譯。②microRNA-146a抑制應(yīng)激性潰瘍炎癥反應(yīng)過表達(dá)microRNA-146a后,能顯著降低應(yīng)激性潰瘍細(xì)胞模型中炎癥關(guān)鍵鏈NF-κB的表達(dá),顯著減少M(fèi)DA產(chǎn)生以及增加SOD活性,證明miRNA-146a在應(yīng)激性潰瘍炎癥反應(yīng)中起負(fù)反饋調(diào)控作用。結(jié)論:1、應(yīng)激性潰瘍能夠引起小鼠胃黏膜和人胃腺癌AGS細(xì)胞中microRNA-146a的表達(dá)上調(diào),可能參與了發(fā)生發(fā)展過程。2、microRNA-146a能通過其靶基因APPL1負(fù)性調(diào)控應(yīng)激性潰瘍炎癥反應(yīng)過程。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R632.1
【部分圖文】：

實(shí)驗組 對照組圖 1 小鼠全胃病理切片（100 倍）激性潰瘍時胃黏膜 miRNAs 表達(dá)的變化索應(yīng)激時胃黏膜 miR-146a 和 NF-kB p65 的表達(dá)，我們采用基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，實(shí)驗組 miR-146a P<0.01），NF-kB p65 的表達(dá)升高 2 倍余（P<0.01），如圖 2。****0.40.50.60.70.80.91laitvexpEresismo

pMIR-REPORTTMLuciferace報告基因質(zhì)粒圖譜

21圖 5 pRL-TK 質(zhì)粒圖譜-146a 靶基因的預(yù)測 應(yīng)用應(yīng)用 TargetScan 和 Miranda 生物miR-146a 的靶基因，選擇基因片段存在有 7 個互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)用靶點(diǎn)。素酶報告載體實(shí)驗鑒定 miR-146a 的靶基因基因的構(gòu)建與建立 根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的靶基因 APPL1
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2864905