發(fā)布時間：2020-10-31 07:31

　　 目的:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor Necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis factor,TNF)超家族新成員。體外實(shí)驗發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)多種組織來源的腫瘤細(xì)胞凋亡,而對正常組織細(xì)胞幾乎沒有影響。但有關(guān)TRAIL對破骨細(xì)胞作用的研究報道并不多見。繼往的研究已證實(shí)環(huán)化變構(gòu)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Circular Permuted TRAIL,CPT;北京沙東生物技術(shù)有限公司研發(fā))可以較TRAIL更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們研究CPT對人外周血來源的破骨細(xì)胞的作用,在mRNA水平分析化療藥作用后其兩種CPT死亡受體和兩種誘騙受體表達(dá)的變化,探討CPT對破骨細(xì)胞的作用機(jī)制,為臨床骨髓瘤骨病等的治療新的治療方法和理論依據(jù)。方法:1人外周血來源破骨細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)采取健康人外周血10ml,共6人份。淋巴細(xì)胞分離液無菌分離PBMC,接種24孔板,接種密度分別為5×10~5、1×10~6、2×10~6細(xì)胞/每孔,加入含30ng/ml M-CSF+30ng/ml RANKL培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)21天形成貼壁、胞體較大形狀不規(guī)則且多核(大于等于3個核)的細(xì)胞。2破骨細(xì)胞的鑒定2.1抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)試劑盒染色,多個核(大于等于三個核)、胞體較大、酒紅色細(xì)胞為成熟破骨細(xì)胞。取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的預(yù)置爬片,按照TRAP染色步驟進(jìn)行染色。用顯微鏡(100×)普通光照下觀察并拍照。每次取4個孔,隨機(jī)選取10個視野計數(shù)3個核以上的破骨細(xì)胞。2.2掃描電子顯微鏡觀察破骨細(xì)胞作用于牛皮質(zhì)骨片后形成的骨吸收陷窩。3 CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡3.1不同濃度CPT對破骨細(xì)胞作用,CPT藥物濃度分別為0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml,作用24小時、48小時后進(jìn)行trap染色,倒置顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞形態(tài)變化。3.2annexinv–fitc熒光染色法檢測CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡:將CPT0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml處理后的破骨細(xì)胞在annexinv–fitc熒光染色劑中37℃孵育15分鐘,熒光顯微鏡下觀察凋亡的破骨細(xì)胞。4rt-pcr法檢測破骨細(xì)胞中CPT受體mrna表達(dá)變化的影響以0ng/ml、100ng/ml、500ng/mlCPT處理破骨細(xì)胞24h、48h后,實(shí)時熒光定量pcr(realtimefluorescencequantitativepcr,rt-pcr)法檢測dr4、dr5、dcr1及dcr2mrna水平表達(dá)變化,分析其與CPT誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。5統(tǒng)計學(xué):應(yīng)用spss19.0(spssinc,usa)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差(one-wayanova)分析,統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。大寫字母代表著差異性極顯著(p0.01);小寫字母代表著差異性顯著(p0.05)。結(jié)果:1外周血單個核細(xì)胞經(jīng)m-csf及rankl誘導(dǎo)21天后顯微鏡下可見到大量成熟的破骨細(xì)胞,其形態(tài)學(xué)特征為:細(xì)胞體積較大,細(xì)胞漿豐富呈酒紅色,多核,細(xì)胞核≥3個,甚至多達(dá)數(shù)十個。該細(xì)胞進(jìn)行trap染色呈現(xiàn)陽性(酒紅色),進(jìn)行骨片吸收實(shí)驗顯示其較強(qiáng)的骨吸收活性。證實(shí)可以經(jīng)pbmc誘導(dǎo)形成具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞。在相同的培養(yǎng)條件下pbmc細(xì)胞在2×10~6個/ml接種密度下,誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量為50.2±11.6/hpf,于5×10~5個/ml誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量18.0±6.37/hpf及1×10~6個/ml誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量36.4±9.54/hpf相比,誘導(dǎo)形成的破骨細(xì)胞數(shù)量最多。2CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化,顯微鏡下觀察到CPT作用24小時后破骨細(xì)胞出現(xiàn)空泡化、變形,48h后破骨細(xì)胞的封閉帶出現(xiàn)破裂或者消失等凋亡特征。3CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞早期凋亡凋亡annexinv–fitc熒光染色,熒光顯微鏡下觀察到不同濃度CPT作用于破骨細(xì)胞后典型的早期凋亡特征,CPT誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)一定的時間-濃度依賴性。4CPT對破骨細(xì)胞CPT相關(guān)受體mrna表達(dá)的影響:dr4、dr5、DcR1及DcR2在破骨細(xì)胞上均有表達(dá)。經(jīng)100ng/ml、500ng/mlCPT處理破骨細(xì)胞24h,CPT的相關(guān)受體DR4、DR5、DcR1及DcR2的mRNA表達(dá)水平變化不顯著(P0.05);處理48h后,DR4和DcR2的mRNA表達(dá)水平仍無顯著變化(P0.05),DR5及DcR1的mRNA表達(dá)水平下調(diào)(P0.05或P0.01)。推斷CPT是通過DR5誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1可以由人PBMC誘導(dǎo)形成的具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞。2 CPT可誘導(dǎo)人外周血源的破骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。其誘導(dǎo)作用呈時間及濃度依賴性。3 CPT作用破骨細(xì)胞一定時間后可降低DR5、DcR1的mRNA表達(dá),但不影響受體DR4、DcR2mRNA表達(dá),推斷CPT通過DR5、DcR1參與調(diào)控OC的凋亡。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

18附 圖圖1-1 接種不同密度PBMC誘導(dǎo)產(chǎn)生的TRAP陽性破骨細(xì)胞（A：5×105個/ml；B：1×106個/ml；C：2×106個/ml）（100X）Fig.1-1After the induction of different cell seeding density, the osteoclastswere observed in TRAP staining圖1-2 不同細(xì)胞接種密度誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞數(shù)量（100X）Fig.1-2 StatisticalAnalysis of the osteoclast number注：大寫字母代表著差異性極顯著（P<0.01）；小寫字母代表著差異性顯著（P<0.05）Different lower alphabets and upper alphabets were considered to indicatesignificance (P<0.05) and high significance (P<0.01), respectively

Fig.1-1After the induction of different cell seeding density, the osteoclastswere observed in TRAP staining圖1-2 不同細(xì)胞接種密度誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞數(shù)量（100X）Fig.1-2 StatisticalAnalysis of the osteoclast number注：大寫字母代表著差異性極顯著（P<0.01）；小寫字母代表著差異性顯著（P<0.05）Different lower alphabets and upper alphabets were considered to indicatesignificance (P<0.05) and high significance (P<0.01), respectively

研 究 論 文19圖1-3 骨吸收陷窩Fig. 1-3 Resorption lacunae圖2-1 RNA瓊脂糖凝膠電泳Figure 2-1 RNAto agarose gel electrophoresis圖 2-2 CPT 對破骨細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）Fig.2-2 Effects of CPT on osteoclast morphology（100×）28s18s5s
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Lianping Xing;Yan Xiu;Brendan F Boyce;;Osteoclast fusion and regulation by RANKL-dependent and independent factors[J];World Journal of Orthopedics;2012年12期

2 潘淳;何波;楊雪婷;陳鵬;沈志強(qiáng);;誘導(dǎo)法與機(jī)械法體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞的比較研究[J];昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2012年09期

本文編號：2863642