發(fā)布時間：2020-10-28 02:35

　　 研究背景:股骨頭壞死(Osteonecrosis of Femoral Head,ONFH)是以股骨頭血供受損,骨細胞及骨髓成份死亡,繼而導致股骨頭結(jié)構改變、股骨頭塌陷、關節(jié)功能障礙為特征的骨科常見疾病,高發(fā)于青壯年。因股骨頭壞死塌陷而行全髖關節(jié)置換術的患者占全部全髖關節(jié)置換總數(shù)的30%,為家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。在中國,激素的應用仍為股骨頭壞死發(fā)生的首要危險因素,激素性股骨頭壞死約占股骨頭壞死總數(shù)的35%。目前,激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制仍不明確,因而限制了對于激素性股骨頭壞死早期診斷方法和干預手段的發(fā)展。研究表明,骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的數(shù)量減少及細胞行為的改變與激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展密切相關。然而,對于激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性改變存在爭議。在前期研究中,課題組在激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞中發(fā)現(xiàn)了差異表達的miRNA。然而,miRNA的差異表達不能完全闡釋激素性股骨頭壞死的發(fā)生機制,多種非編碼RNA可以在轉(zhuǎn)錄組層面進行相互作用從而調(diào)節(jié)基因表達。因此,全面的理解激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞中的轉(zhuǎn)錄組差異表達可能為進一步的探索其發(fā)生機制提供條件。研究目的:1.比較激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞與正常對照之間的細胞功能差異。2.利用高通量測序及生物信息學分析技術,在轉(zhuǎn)錄組層面研究激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞差異基因表達。3.在 BMSC 探索差異 lncRNA:lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和lncRNA-RP3-331H24.7 對 BMSC 功能影響4.初步探索 lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7 與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 的相互作用機制。研究方法:1.骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng):從7例激素性股骨頭壞死患者和7例正常對照體內(nèi)取骨髓組織,密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞并傳代,流式細胞術對細胞表型進行驗證。2.通過CCK-8和Edu增殖實驗、AnnexinV-PI凋亡實驗比較兩組骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖能力和凋亡率的差異;誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨、成脂方向分化,通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色以及成骨、成脂標記物的表達情況比較兩組之間的分化能力差異。3.通過高通量全基因組測序?qū)山M中各3例骨髓間充質(zhì)干細胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序,得到激素性股骨頭壞死過程中差異表達的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA。4.通過生物信息學手段對差異基因進行功能富集分析,并對lncRNA和mRNA、circRNA和miRNA進行共表達分析,揭示其相互作用機制。5.在正常BMSC中過表達/低表達過表達lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7,觀察其在 BMSC 中與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p的相互作用以及對于BMSC功能的影響。研究結(jié)果:1.分離骨髓間充質(zhì)干細胞,表面抗原鑒定顯示CD29,CD44,CD73,CD90和CD105呈陽性表達,而CD31和CD45呈陰性表達。2.激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)24h、48h和72h后,CCK-8吸光度值均顯著低于正常對照(24h:0.35±0.02vs0.39±0.04,P=0.02;48h:0.54±0.06 vs0.68±0.08,P=0.004;72h:0.92±0.04vs1.15±0.08,P=0.0006)。培養(yǎng) 24h 后其Edu陽性率為26.67%± 10.85%,顯著低于正常對照的66.03%± 8.71%(p=0.0021),提示激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力降低。而其總凋亡率為24.64±3.68%,較正常對照組顯著增高(17.48±4.05%,p=0.0041)。3.通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色以及成骨(ALP,OCN,RUNX2和BSP)、成脂標記物(PPARY,LPL和FABP4)的檢測,發(fā)現(xiàn)激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力減弱,成脂分化能力增強。4.在激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞中發(fā)現(xiàn)3114個mRNA、572個lncRNA、224個miRNA和231個circRNA差異表達并構建共表達網(wǎng)絡。5.lncRNA-RP11-154D6 與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 的表達趨勢呈正相關,且lncRNA-RP11-154D6 可以抑制 BMSC 增殖并促進凋亡;lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7能夠促進BMSC增殖并抑制凋亡過程,且其表達趨勢與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 呈負相關。結(jié)論:1.激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、凋亡及分化能力均較正常細胞改變,可能是導致激素性股骨頭壞死發(fā)生的原因。2.激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞中存在異常表達的mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA,這些異常表達的基因可能通過相互作用影響細胞功能,從而調(diào)控激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展。3.lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7 可能通過與miR-30a-5p和miR-30c-5p的相互作用,調(diào)控BMSC增殖和凋亡過程。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R681.8
【部分圖文】：

實驗結(jié)果??１．骨髄間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察及表型鑒定??骨髓間充質(zhì)干細胞貼壁培養(yǎng)時呈長梭形，漩渦狀排列。既往文獻報道其表面標記??ＣＤ２９，?ＣＤ４４，?ＣＤ７３，?ＣＤ９０?和?ＣＤ１０５?陽性；ＣＤ３１?和?ＣＤ４５?陰性。??在本研究中，培養(yǎng)初期，可見少量梭形貼壁細胞，并伴有大量未貼壁圓形細胞。??延長培養(yǎng)時間并不斷更換培養(yǎng)基后貼壁細胞逐漸增多，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，局??部有突起，培養(yǎng)１４天后，細胞匯合度可達８０％，細胞呈旋渦狀排列（圖１Ｈ）。??收集第３代骨髓間充質(zhì)干細胞，通過流式細胞術檢測其表面抗體表型，發(fā)現(xiàn)ＣＤ２９，??ＣＤ４４，ＣＤ７３，ＣＤ９０?和?ＣＤ１０５?呈陽性表達，表達率分別為?１００％，?９２．８％，９７．９％，??９５．４％和９９．９％，而ＣＤ３１和ＣＤ４５呈陰性表達，表達率分別為２．６％和０．８％?（圖??１Ａ－Ｇ）。??Ａ?Ｂ?Ｃ?Ｄ??

圖２Ｂ，??Ｐ＝０．０２）

?中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院博士研宄生學位論文???圖２激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力下降??３．激素性股骨頭壞死患者骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡率明顯升髙??我們通過ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ染色法對兩組中全部１４例骨髓間充質(zhì)干細胞進行了凋亡??檢測。在激素性股骨頭壞死組全部７例骨髓間充質(zhì)干細胞中，總凋亡率為??２４．６４±３．６８％，較正常對照組顯著增高（１７．４８±４．０５％，ｐ＝０．００４１）。其中，兩組細??胞之間的早期凋亡率未見統(tǒng)計學差異（６．４２±２．１３°／〇ｖｓ５．２９±２．１６°／。；ｐ＝０．４４５８），而??激素性股骨頭壞死組骨髓間充質(zhì)干細胞的晚期凋亡細胞比例較正常顯著增高，兩??者具有統(tǒng)計學差異（１８．２１±３．０８％ｖｓｌ２．１９±２．００％；ｐ＝０．０００６）。圖３Ａ羅列了兩組??中各３例凋亡檢測的代表性結(jié)果（上列為激素性股骨頭壞死組，下列為正常對照??組），圖３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ分別顯示了兩組骨髓間充質(zhì)干細胞早期凋亡率、晚期凋亡??率和總凋亡率的統(tǒng)計學結(jié)果。??Ａ??
【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 程相國;胡斌;盛加根;張長青;;應用基因芯片技術對激素性股骨頭缺血性壞死差異表達基因篩選的初步研究[J];中國修復重建外科雜志;2014年05期

2 夏天;肖丙秀;郭俊明;;長鏈非編碼RNA的作用機制及其研究方法[J];遺傳;2013年03期

3 張馳;;成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix對骨形成作用的分子機制(英文)[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2012年05期

本文編號：2859444