研究背景燒傷創(chuàng)面的治療一直是燒傷醫(yī)學(xué)臨床和實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。臨床工作中,通常利用三度四分法進(jìn)行燒燙傷的分度,并指導(dǎo)患者的治療。Ⅰ度及淺Ⅱ度燒傷通常經(jīng)過(guò)保守治療可以治愈,Ⅲ度燒傷通常需要植皮或皮瓣覆蓋等手術(shù)治療,而深Ⅱ度燒傷介于兩者之間。深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間長(zhǎng),愈后形成瘢痕,且治療過(guò)程中容易并發(fā)感染導(dǎo)致創(chuàng)面加深。因此,闡明深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合機(jī)制及尋求創(chuàng)面愈合的有效治療方法仍是目前亟需解決的重要問題。創(chuàng)面愈合是一個(gè)多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的過(guò)程,主要分為炎癥反應(yīng)期、新生組織形成期、組織重塑期三個(gè)不可分割的階段。既往研究顯示,調(diào)控炎癥反應(yīng)、加速創(chuàng)面上皮化可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。Sestrin2(SESN2)屬于sestrin家族,是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白,具有調(diào)節(jié)代謝、抗老化和抑制肥胖等功能。研究表明當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激、低氧等刺激時(shí),SESN2表達(dá)顯著升高,通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)自噬、對(duì)抗氧化應(yīng)激、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)SESN2在多種疾病中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并促進(jìn)炎性損傷后上皮細(xì)胞的恢復(fù)。課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面SESN2 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高,提示SESN2在創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮作用。由此,我們提出如下假說(shuō):深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面SESN2表達(dá)升高,通過(guò)抑制創(chuàng)面炎癥因子的釋放抑制炎癥反應(yīng),并通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移促進(jìn)創(chuàng)面愈合。為探討SESN2在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合中的作用,本研究擬通過(guò)建立動(dòng)物深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面模型,局部給予SESN2的激動(dòng)劑eupatilin以及轉(zhuǎn)染SESN2的干擾RNA(si-SESN2),調(diào)控創(chuàng)面局部SESN2的表達(dá)水平,在體觀察SESN2對(duì)創(chuàng)面愈合炎癥及組織增生階段的影響,并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步探討相關(guān)的細(xì)胞分子機(jī)制。研究目的通過(guò)對(duì)SESN2在深Ⅱ度燒傷小鼠創(chuàng)面炎癥反應(yīng)期及新生組織形成期表達(dá)規(guī)律的觀察分析,研究確定SESN2在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用,并深入探討相關(guān)的細(xì)胞分子機(jī)制,為臨床尋找有效的深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面治療途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法1.建立C57BL/6深Ⅱ度燒傷模型。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組,包括正常對(duì)照組和燒傷2 s、4 s、6 s實(shí)驗(yàn)組。小鼠背部脫毛處理后24 h,采用92℃熱蒸汽在3個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠背部制作直徑1.5 cm的圓形創(chuàng)面,分別燒傷2 s、4 s、6 s,每組于傷后即刻及傷后12 h、24 h、48 h留取創(chuàng)面區(qū)域全層皮膚標(biāo)本,制作石蠟切片,行HE染色觀察確定不同致傷條件組動(dòng)物皮膚燒傷深度。2.觀察SESN2在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的表達(dá)變化。制作C57BL/6背部深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面,分別于傷后12 h、24 h、2 d、4 d、7 d取材,通過(guò)Real-time PCR、免疫組化及Western blot等方法檢測(cè)創(chuàng)面組織SESN2的表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)傷后炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)水平。3.通過(guò)應(yīng)用SESN2激動(dòng)劑或干涉SESN2,觀察深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合中SESN2的作用。將C57BL/6小鼠分為4組,對(duì)照組、eupatilin注射組、si-NC注射組和si-SESN2注射組,脫毛后分別以生理鹽水、eupatilin、si-NC或si-SESN2注射于小鼠背部皮膚。24 h后于小鼠背部注射處理區(qū)域制作深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面,此后每隔24 h在各組小鼠背部創(chuàng)面周圍注射生理鹽水、eupatilin、si-NC或si-SESN2,直至創(chuàng)面愈合。觀察并記錄創(chuàng)面愈合情況。以Real-time PCR、免疫組化及Western blot等方法檢測(cè)SESN2在創(chuàng)面愈合中對(duì)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖遷移的影響,分析確定SESN2在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合中的作用。4.SESN2在熱處理后的HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移的影響。首先,HaCaT細(xì)胞熱處理后通過(guò)Real-time PCR及Western-blot檢測(cè)SESN2的表達(dá)變化。再將HaCaT分為對(duì)照組、eupatilin組、si-NC組及si-SESN2組,通過(guò)Real-time PCR明確熱處理后SESN2對(duì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響,以EDU實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察熱處理后SESN2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響,劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)觀察熱處理后SESN2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移能力的影響。5.SESN2促進(jìn)深Ⅱ度創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制研究。通過(guò)對(duì)HaCaT細(xì)胞SESN2表達(dá)的調(diào)節(jié),觀察AMPK、NF-κB、ERK信號(hào)通路分子的磷酸化狀態(tài),探討SESN2對(duì)促進(jìn)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合可能的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.HE染色顯示4 s燒傷組小鼠皮膚表皮全層及真皮深層損傷,但有毛囊、皮脂腺殘存,傷后24 h創(chuàng)面損傷程度穩(wěn)定,符合深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面組織損傷病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。2.免疫組化結(jié)果顯示C57BL/6小鼠皮膚創(chuàng)緣部位SESN2染色最明顯,傷后24h染色最深。創(chuàng)緣部位皮膚組織行Real-time PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,燒傷后SESN2的mRNA及蛋白表達(dá)量均呈一過(guò)性升高,傷后24 h達(dá)到峰值(P0.05),隨后逐漸下降至7 d時(shí)SESN2表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P0.05)。傷后24 h TNF-α、IL-1β、IL-6水平較對(duì)照組明顯升高且有顯著差異(P0.01),HE染色顯示真皮層炎癥小體明顯增多。Ki-67表達(dá)量在傷后4 d高于對(duì)照組且有顯著差異(P0.05),傷后7 d即降低至與對(duì)照組無(wú)差異(P0.05)。3.計(jì)算創(chuàng)面剩余面積占最初燒傷面積的百分比,分析比較組間創(chuàng)面愈合率。與對(duì)照組相比,si-SESN2組創(chuàng)面愈合速度在7 d、21 d時(shí)均顯著降低(P0.05)。eupatilin處理組與對(duì)照組相比,在傷后7 d內(nèi)愈合速度無(wú)明顯差異,但是第14 d和第21 d時(shí),eupatilin處理組的愈合率顯著高于對(duì)照組(P0.01)。結(jié)果提示SESN2在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面中具有促進(jìn)傷口愈合的作用。4.Real-time PCR證實(shí)C57BL/6小鼠si-SESN2組創(chuàng)面中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)顯著升高(P0.01),Ki-67的表達(dá)明顯降低(P0.01),提示SESN2低表達(dá)使深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面發(fā)生過(guò)度炎癥反應(yīng)、降低細(xì)胞增殖能力。5.HaCaT細(xì)胞熱處理后,SESN2的mRNA表達(dá)在1 h出現(xiàn)一過(guò)性升高隨即下降,4 h后表達(dá)即與對(duì)照組無(wú)差異。Western blot結(jié)果同樣顯示細(xì)胞熱處理后SESN2蛋白水平一過(guò)性升高,峰值出現(xiàn)在處理后2 h(P0.01)。Real-time PCR檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6結(jié)果顯示,eupatilin處理組炎癥因子水平較對(duì)照組顯著降低(P0.01),而si-SESN2處理組則顯著高于對(duì)照組(P0.01);劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí),給予eupatilin提高SESN2表達(dá)可以增強(qiáng)HaCaT細(xì)胞的遷移能力,而si-SESN2處理組細(xì)胞遷移速率減慢;CCK8實(shí)驗(yàn)及EDU實(shí)驗(yàn)證實(shí)干涉SESN2抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力。6.對(duì)SESN2/AMPK/NF-κB通路研究結(jié)果顯示,同空白對(duì)照組相比,上調(diào)SESN2的表達(dá)可以提高AMPK磷酸化水平,抑制NF-κB的磷酸化。而給予AMPK抑制劑后雖然NF-κB磷酸化水平升高,但通過(guò)上調(diào)SESN2表達(dá)不能抑制NF-κB磷酸化。對(duì)SESN2/ERK通路研究顯示,上調(diào)SESN2表達(dá)可以促進(jìn)ERK磷酸化,轉(zhuǎn)染si-SESN2后ERK磷酸化水平下降。提示SESN2通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng),同時(shí)可激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移過(guò)程。研究結(jié)論1.使用92℃熱蒸汽對(duì)C57BL/6小鼠背部皮膚持續(xù)燒傷4 s,可以獲得穩(wěn)定的深Ⅱ度燒傷模型。2.提高深Ⅱ度燒傷創(chuàng)緣組織中SESN2表達(dá),可以促進(jìn)C57BL/6小鼠創(chuàng)面愈合。3.SESN2通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移和增殖的方式促進(jìn)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合。4.SESN2通過(guò)AMPK/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抑制炎癥的作用,通過(guò)ERK信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移的作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R644
【部分圖文】：

圖 1. 燒傷創(chuàng)面組織病理?yè)p傷分度（楊宗城. 燒傷治療學(xué). 人民衛(wèi)生出版社, 2006.8）2. 深Ⅱ度燒傷的形態(tài)學(xué)變化及愈合方式深Ⅱ度燒傷存在真皮網(wǎng)狀層損傷，但深層的真皮組織及其中的部分皮膚附件結(jié)構(gòu)仍健在。肉眼可見表皮及真皮組織凝固壞死、形成黃白色痂皮，痂皮內(nèi)散在紅點(diǎn)，此為殘存的皮膚附件周圍充血的毛細(xì)血管叢。鏡下可見細(xì)胞凝固型壞死達(dá)到全部表皮層和深部真皮層，原有組織結(jié)構(gòu)消失，壞死、腫脹的膠原纖維發(fā)生融合，部分皮膚附件輪廓可見。深Ⅱ度燒傷于受傷 12 小時(shí)后，大量白細(xì)胞浸潤(rùn)于壞死組織和存活組織之間，形成“浸潤(rùn)帶”，此后痂皮會(huì)沿浸潤(rùn)帶脫離，新生上皮沿浸潤(rùn)帶延伸；殘存的皮膚附件上皮再生出現(xiàn)新生上皮而后形成上皮島，上皮島擴(kuò)大、融合促使創(chuàng)面愈合。二、創(chuàng)面愈合

-17-圖 2. 創(chuàng)面愈合過(guò)程(Gurtner GC, et al. Wound repair and regeneration. Nature, 2008;453,314-32炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)在組織愈合過(guò)程中起著不可或缺的作用，是體內(nèi)平衡重建的基損傷后，壞死碎片、凝血反應(yīng)和侵入體內(nèi)的微生物共同激活通過(guò)局部釋而傳播的炎癥反應(yīng)（圖 3）。炎癥反應(yīng)從血管內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)滾動(dòng)、

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文式與血管內(nèi)皮相互作用開始，隨后中性粒細(xì)胞在受到幾種具細(xì)胞膜蛋白改變的炎癥介質(zhì)影響的情況下向病灶聚集[26]。在，嗜中性粒細(xì)胞被募集并通過(guò)釋放細(xì)胞質(zhì)顆粒中所含的蛋白子介導(dǎo)組織損傷[27]。這些細(xì)胞產(chǎn)生 ROS 及抗微生物蛋白酶，幫[28]，并隨后協(xié)調(diào)組織修復(fù)反應(yīng)。
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