背景:動脈新生內(nèi)膜形成引起動脈狹窄,最終導(dǎo)致組織缺血缺氧,是引起心力衰竭或移植物衰敗的主要原因,其分子機(jī)制目前尚不明確。Toll樣受體4(TLR4)作為固有免疫的重要組成部分,其在感染性疾病中的作用已得到較為詳盡的闡述,但在動脈新生內(nèi)膜形成中的作用及其可能的潛在機(jī)制,尚未得到闡明。目的:探討TLR4信號通路在小鼠大動脈新生內(nèi)膜形成中的作用及其分子機(jī)制,尋找可能可行的治療藥物。方法:第一部分1.建立小鼠同種主動脈移植模型,將BALB/c(H-2d)供體主動脈移植到C57BL/6(H-2b)受體中,檢測移植物血管相關(guān)的病理變化,TLR4的表達(dá)及定位。2.TLR4抑制劑干預(yù):對小鼠血管移植模型給予TLR4特異性抑制劑TAK-242處理,手術(shù)前1天、手術(shù)當(dāng)天以及隨后每隔一天,持續(xù)8-12周。3.檢測手段和指標(biāo):(1)免疫組化及免疫熒光染色檢測損傷血管浸潤的炎癥細(xì)胞及TLR4表達(dá)情況;(2)RT-q PCR、蛋白印跡檢測TLR4信號通路的表達(dá);(3)FACS檢測巨噬細(xì)胞的比例;(4)ELISA檢測共培養(yǎng)體系中炎癥因子和趨化因子的表達(dá);(5)建立共培養(yǎng)體系及細(xì)胞趨化試驗(yàn)確認(rèn)作用靶點(diǎn)。第二部分1.建立小鼠內(nèi)膜增生/動脈重構(gòu)模型,將右頸總動脈與頸動脈分叉處附近用絲線縫合結(jié)扎,檢測病變血管相關(guān)的病理變化。2.CD40抗體及CD40/TRAF抑制劑干預(yù):對小鼠內(nèi)膜增生/動脈重構(gòu)模型給予CD40抗體或者CD40/TRAF抑制劑6877002,持續(xù)4周。3.檢測方法和指標(biāo):(1)免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色測病變血管浸潤的炎癥細(xì)胞;(2)RT-q PCR、膠原酶活性檢測測定MMPs的表達(dá);(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞,B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例;(5)培養(yǎng)骨髓巨噬細(xì)胞檢測藥物作用。結(jié)果:第一部分1.本研究成功建立小鼠主動脈移植模型,同種移植移植物血管內(nèi)膜增生明顯多于同系移植物,炎性細(xì)胞浸潤程度也明顯較同系移植物重。TLR4參與小鼠主動脈移植模型的血管內(nèi)膜增生,其主要定位在巨噬細(xì)胞。2.TLR4抑制劑TAK-242阻斷TLR4減輕同種異體主動脈移植中的內(nèi)膜增生,推遲新生內(nèi)膜的形成;TAK-242通過降低移植后外周血,骨髓和脾臟中Ly6Chi巨噬細(xì)胞的生成,減少移植物局部CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤。3.TLR4抑制劑TAK-242通過抑制NF-κB信號通路削弱小鼠血管移植模型中IL12p70/IFNγ軸的影響,從而減少移植物新生內(nèi)膜中促炎細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá),減少了CCL2介導(dǎo)的血管平滑肌遷移。第二部分1.本研究成功建立小鼠血管內(nèi)膜增生/動脈重構(gòu)模型,TLR4下游CD40阻斷后減輕新生內(nèi)膜形成和動脈重塑,降低新生內(nèi)膜形成和動脈重塑中明膠酶和膠原酶的活性。2.TLR4下游CD40/TRAF6抑制劑6877002的使用能明顯減輕新生內(nèi)膜形成和動脈重塑,減少炎癥浸潤和膠原轉(zhuǎn)換,明顯抑制了M1極化反應(yīng),誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞亞型的生成。結(jié)論:1.TLR4參與了小鼠主動脈移植模型和小鼠血管內(nèi)膜增生/動脈重構(gòu)模型的新生內(nèi)膜形成。其主要機(jī)制可能為:(1)參與巨噬細(xì)胞極化,促進(jìn)炎癥因子的分泌;(2)促進(jìn)IL12p70/IFNγ軸自循環(huán),進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)。2.TLR4的抑制劑以及CD40/TRAF6抑制劑分別可明顯減兩種新生內(nèi)膜形成模型的血管病變。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R654
【部分圖文】：

27圖 2.1 小鼠血管移植模型的建立，其免疫指標(biāo)的變化及 TLR4 表達(dá)情況二、 阻斷 TLR4 對小鼠血管移植模型血管移植物內(nèi)膜增生的影響1. TLR4 抑制劑 TAK-242 對血管移植物內(nèi)膜增生的影響為了解 TLR4 在小鼠血管移植模型血管移植物內(nèi)膜增生中的作用，使用 TLR4 小分子特異性抑制劑 TAK-242 對同種移植小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分四組，包括溶劑組、TAK-242 3mg/kg 治療組、TAK-242 10mg/kg 治療組和同系移植組。溶劑組、TAK-242 3mg/kg 治療組和 TAK-242 10mg/kg 治療組均為同種移植，將 BALB/c 小鼠的主動脈移植到 B6 小鼠體內(nèi)，而同系移植組則將 B6 用作供體和受體。按照分組腹腔注射不同藥物，在手術(shù)前一天單獨(dú)注射一次，手術(shù)當(dāng)天至手術(shù)后第 84 天，每隔一天腹腔注射一次。TAK-242 3mg/kg 治療組和 TAK-242 10mg/kg 治

28圖 2.2 阻斷 TLR4 對小鼠血管移植模型血管移植物內(nèi)膜增生的影響在移植術(shù) 8 周后，所有小鼠均存活，并無外觀上的差異。按上述方法取血管移植物組織進(jìn)行 H＆E 染色，顯示在 8 周時(shí)與同系移植組相比，同種異體移植的各組均出現(xiàn)更明顯的同心性內(nèi)膜增生病變（圖 2.2.A）。通過計(jì)算內(nèi)膜中膜比（I/M ratio）發(fā)現(xiàn)，

30圖 2.3 TLR4 抑制劑 TAK-242 對血管移植物早期炎癥細(xì)胞浸潤的影響3. TLR4 抑制劑 TAK-242 對外周血，骨髓和脾臟中 Ly6Chi 巨噬細(xì)胞水平的影響炎癥發(fā)生時(shí)，循環(huán)炎性 Ly6Chigh 單核細(xì)胞滲入組織，并通過產(chǎn)生細(xì)胞因子，蛋白酶和氧化應(yīng)激促進(jìn)酶導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生[27]，構(gòu)成局部浸潤巨噬細(xì)胞的主要來源[28]。。為了研究 TAK-242 如何影響循環(huán)單核細(xì)胞的募集，通過流式細(xì)胞術(shù)評估溶劑組，TAK-242 治療組和同系移植組的外周血，骨髓和脾單核細(xì)胞。按方法部分描述制備各種單細(xì)胞懸液，染色采用抗 CD11b-FITC 熒光抗體，抗 CD115-PE 熒光抗體和抗Ly6C-PERCP-Cy5.5 熒光抗體。在 CD11b+的細(xì)胞中，選出 CD115+且 Ly6Chi 的細(xì)胞。在溶劑處理的小鼠中，外周血 Ly6Chi 單核細(xì)胞占 CD11b+細(xì)胞的 12.07±0.47％，但在
【參考文獻(xiàn)】

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1 王薇;武陽豐;趙冬;楊穎;梁立榮;王淼;解武祥;孫佳藝;周廣華;史平;任福秀;霍勇;;中老年人群頸動脈粥樣硬化分布特點(diǎn)及影響因素分析[J];中華心血管病雜志;2010年06期

本文編號：2847114