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Resolvin D2對缺血再灌注后腦損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

發(fā)布時間:2020-10-15 03:30
   第一部分Resolvin D2對缺血再灌注后腦損傷的保護(hù)作用研究目的:研究缺血再灌注條件下大鼠腦組織中內(nèi)源性Resolvin D2(RvD2)表達(dá)變化以及外源性給予不同劑量RvD2改善缺血再灌注后腦損傷的效果。方法:1、實(shí)驗(yàn)動物分組:將36只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組,每組6只,分別為假手術(shù)組和5個MCAO/R組,MCAO/R組分為MCAO后12小時,24小時,48小時,72小時和96小時再灌注五個亞組,觀察不同時間點(diǎn)內(nèi)源性RvD2表達(dá)變化。將72只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組,每組12只,分別為假手術(shù)組和5個MCAO/R組(72h),MCAO/R組分別接受vehicle,25ng/kg,50ng/kg和100ng/kg體重的RvD2腹腔注射。2、動物模型制作:利用線栓法制備大鼠MCAO/R模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)進(jìn)行麻醉,沿正中線頸部切開后暴露右側(cè)頸動脈,分離右側(cè)頸外動脈,并在遠(yuǎn)端結(jié)扎其分支。取一段0.26 mm單絲尼龍魚線,頂端緩慢加熱成圓形,通過右側(cè)頸外動脈根部內(nèi)腔和頸內(nèi)動脈進(jìn)入右側(cè)大腦前動脈,造成右側(cè)中動脈起點(diǎn)阻塞。然后清理傷口,縫合手術(shù)切口。栓塞2 h后,去除魚線,制備再灌注模型。假手術(shù)對照不插入尼龍魚線,其余同前。術(shù)中保持肛溫36.5 and 37.5℃。各個時間點(diǎn)處死大鼠、灌注取腦并且留取腦標(biāo)本。3、檢測方法及指標(biāo):通過ELISA法檢測大鼠腦標(biāo)本中RvD2、白介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)定量表達(dá);TTC染色評估可再生的梗塞面積;神經(jīng)行為學(xué)評分法評定神經(jīng)功能缺失;干濕重法評定腦水腫程度;TUNEL評定神經(jīng)元和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMVEC)的凋亡;FJB評定神經(jīng)元壞死。結(jié)果:1.ELISA結(jié)果顯示,與sham組相比,MCAO/R各組內(nèi)源性RvD2表達(dá)明顯下降(P0.01);而在大鼠I/R條件下,48h,內(nèi)源性RvD2表達(dá)至峰值(P0.01);72h,內(nèi)源性RvD2表達(dá)明顯下降。2.ELISA結(jié)果顯示,L-6及TNF-α表達(dá)在MCAO/R后72h最明顯,這一作用在給予MCAO/R+RvD2后明顯改善,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)組改善最明顯(P0.05)。3.TTC染色評估,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)組腦梗塞面積改善最明顯。4.神經(jīng)功能評分,與對照組相比,MCAO/R組神經(jīng)功能缺失明顯(P0.01);與MCAO/R組相比,MCAO/R+RvD2(50 and 100 ng/kg)組神經(jīng)功能缺失明顯改善(P0.001)。5.干濕重法顯示,與MCAO/R組相比,MCAO/R+RvD2治療組腦水腫明顯減輕(P0.05)。6.凋亡細(xì)胞原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)及FLUORO-JADE B熒光染色(FJB)結(jié)果顯示,72h MCAO/R條件下,與MCAO/R組相比,MCAO/R+RvD2治療組神經(jīng)元凋亡明顯減少;相比MCAO/R+RvD2(25 ng/kg)及MCAO/R+RvD2(100 ng/kg)組,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)組神經(jīng)元凋亡數(shù)最少(P0.05);BMVEC凋亡指數(shù)與神經(jīng)元凋亡相一致。MCAO/R+RvD2(50 and 100 ng/kg)組神經(jīng)元壞死改善明顯(P0.05)。結(jié)論:1.缺血再灌注條件下大鼠腦組織中內(nèi)源性RvD2表達(dá)明顯下降;2.外源性給予RvD2可顯著減少神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞的壞死,改善缺血再灌注后腦損傷。第二部分Resolvin D2對缺血再灌注后腦損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究目的:探討Resolvin D2調(diào)控GPR18-ERK1/2-NOS信號通路對缺血再灌注后腦損傷是否有干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制。方法:1、實(shí)驗(yàn)動物分組:將30只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組6只,分別為sham組,MCAO/R組,MCAO/R+vehicle組,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)組,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)+O-1918組。2、動物模型制作:利用線栓法制備大鼠MCAO/R模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)進(jìn)行麻醉,沿正中線頸部切開后暴露右側(cè)頸動脈,分離右側(cè)頸外動脈,并在遠(yuǎn)端結(jié)扎其分支。取一段0.26 mm單絲尼龍魚線,頂端緩慢加熱成圓形,通過右側(cè)頸外動脈根部內(nèi)腔和頸內(nèi)動脈進(jìn)入右側(cè)大腦前動脈,造成右側(cè)中動脈起點(diǎn)阻塞。然后清理傷口,縫合手術(shù)切口。栓塞2 h后,去除魚線,制備再灌注模型。假手術(shù)對照只是不插入尼龍魚線,其余步驟同手術(shù)組。術(shù)中保持肛溫36.5 and 37.5℃。在72h處死大鼠、灌注取腦并且留取腦標(biāo)本檢查。3、檢測方法及指標(biāo):通過蛋白印跡(Western-blot,WB)法檢測大鼠腦標(biāo)本中GPR18的表達(dá)變化;細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)1/2、p-ERK1/2、ZO-1、神經(jīng)元一氧化氮合酶(n NOS)、內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(e NOS)和緊密蛋白zonula occludens-1(ZO-1)的表達(dá)情況;采用免疫熒光染色來分析GPR18在神經(jīng)元及BMVEC中的表達(dá);采用免疫共沉淀法測定GPR18和neurons、v WF的相互作用,n NOS和neuron marker(Neu N)的相互作用,e NOS和endothelial cell marker(v WF)的相互作用;TTC染色評估可再生的梗塞面積。結(jié)果:1.western blot結(jié)果顯示,大鼠I/R后72小時,與sham組相比,MCAO/R組GPR18在腦組織神經(jīng)元及BMVEC中的表達(dá)水平明顯下降(P0.01);與MCAO/R組相比,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)組中GPR18在神經(jīng)元及BMVEC中的表達(dá)明顯增高(P0.05);與MCAO/R組相比,MCAO/R+RvD2組中腦組織及神經(jīng)元中磷酸化的ERK 1/2表達(dá)水平明顯增高(P0.01);與sham組相比,MCAO/R組神經(jīng)元中n NOS表達(dá)水平和BMVEC中e NOS表達(dá)水平明顯下降(P0.05);與MCAO/R組相比,MCAO/R+RvD2組神經(jīng)元中n NOS表達(dá)水平明顯增加,BMVEC中e NOS和ZO-1表達(dá)水平明顯增加(P0.01)。2.免疫共沉淀結(jié)果顯示,GPR18在腦組織中表達(dá)位于神經(jīng)元及BMVEC,而非膠質(zhì)細(xì)胞。3.TTC染色評估,應(yīng)用GPR18拮抗物O-1918后,與MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)組相比,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)+O-1918組腦梗塞面積明顯增加(P0.01)。4.western blot結(jié)果顯示,用O-1918拮抗干預(yù)后,與MCAO/R+RvD2組相比,MCAO/R+RvD2+O-1918組可以明顯降低磷酸化的ERK 1/2表達(dá)(P0.05)、降低n NOS、e NOS和ZO-1表達(dá)(P0.05)。5.免疫熒光染色結(jié)果也顯示,大鼠I/R后72小時,與MCAO/R+RvD2組相比,MCAO/R+RvD2+O-1918組腦組織神經(jīng)元中n NOS表達(dá)明顯降低(P0.05);BMVEC中e NOS表達(dá)明顯降低(P0.05)。結(jié)論:1.RvD2特異性結(jié)合受體GPR18在腦組織中表達(dá)主要位于神經(jīng)元及BMVEC,而非膠質(zhì)細(xì)胞。2.RvD2參與調(diào)控GPR18表達(dá)水平,外源性給予RvD2,可上調(diào)神經(jīng)元及BMVEC中GPR18表達(dá)水平,改善缺血再灌注后腦損傷。3.用O-1918拮抗干預(yù)后,腦梗塞面積增加,RvD2保護(hù)作用減輕,提示RvD2的保護(hù)作用依賴與受體GPR18結(jié)合。4.I/R條件下,RvD2提高ERK 1/2磷酸化,增強(qiáng)n NOS、e NOS和ZO-1表達(dá)水平,RvD2可能通過調(diào)控GPR18-ERK1/2-NOS信號通路減輕I/R后腦損傷。第三部分Resolvin D2與ω-3 fatty acids對缺血再灌注后腦損傷的保護(hù)效果及機(jī)制研究目的:研究對比Resolvin D2與ω-3 fatty acids對缺血再灌注后腦損傷的保護(hù)效果及其機(jī)制。方法:1、實(shí)驗(yàn)動物分組:將30只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組6只,分別為sham組,sham+ω-3組,MCAO/R組,MCAO/R+ω-3組,MCAO/R+Rv D2(50 ng/kg)組。2、動物模型制作:利用線栓法制備大鼠MCAO/R模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)進(jìn)行麻醉,沿正中線頸部切開后暴露右側(cè)頸動脈,分離右側(cè)頸外動脈,并在遠(yuǎn)端結(jié)扎其分支。取一段0.26 mm單絲尼龍魚線,頂端緩慢加熱成圓形,通過右側(cè)頸外動脈根部內(nèi)腔和頸內(nèi)動脈進(jìn)入右側(cè)大腦前動脈,造成右側(cè)中動脈起點(diǎn)阻塞。然后清理傷口,縫合手術(shù)切口。栓塞2 h后,去除魚線,制備再灌注模型。假手術(shù)對照只是不插入尼龍魚線,其余步驟同手術(shù)組。術(shù)中保持肛溫36.5 and 37.5℃。在各個時間點(diǎn)處死大鼠、灌注取腦并且留取腦標(biāo)本檢查。3、檢測方法及指標(biāo):通過ELISA法檢測大鼠腦標(biāo)本中Rv D2表達(dá)變化;通過蛋白印跡(Western-blot,WB)法檢測大鼠腦標(biāo)本中5-lipoxygense(5-LOX)and Phos-5-LOX的表達(dá)變化;TTC染色評估可再生的梗塞面積。結(jié)果:1.TTC染色評估,大鼠I/R后72小時,與MCAO/R+vehicle組相比,MCAO/R+ω-3組梗塞面積減少(P0.05),MCAO/R+Rv D2組腦梗塞面積明顯減少(P0.01),與MCAO/R+ω-3組相比,MCAO/R+Rv D2組腦梗塞面積減少(P0.05)。2.ELISA結(jié)果顯示,與sham組相比,sham+ω-3組(P0.01)、MCAO/R+ω-3組(P0.05),MCAO/R+Rv D2(P0.01)三組中Rv D2表達(dá)上升(P0.01)。大鼠I/R后72小時條件下,與MCAO/R+vehicle組組相比,MCAO/R+ω-3組大鼠腦組織中Rv D2表達(dá)上升(P0.05),MCAO/R+Rv D2組大鼠腦組織中Rv D2表達(dá)明顯上升(P0.01);與sham+ω-3組相比,MCAO/R+ω-3組Rv D2表達(dá)明顯下降(P0.05);與MCAO/R+ω-3組相比,MCAO/R+Rv D2中,Rv D2表達(dá)明顯上升(P0.05)。3.Western-blot結(jié)果顯示,與sham組相比,MCAO/R各組Phos-5-LOX明顯下降(P0.01);而在大鼠I/R條件下,48h,Phos-5-LOX表達(dá)達(dá)峰值(P0.01);72h,Phos-5-LOX表達(dá)明顯下降,這一趨勢與ELISA中內(nèi)源性Rv D2表達(dá)趨勢一致。結(jié)論:1.Resolvin D2對比ω-3 fatty acids對缺血再灌注后腦損傷具有更好的神經(jīng)保護(hù)作用。2.MCAO/R條件下,5-LOX磷酸化受阻,Phos-5-LOX表達(dá)下降致ω-3 fatty acids代謝為Rv D2過程抑制,最終內(nèi)源性Rv D2表達(dá)水平下降,可能是Resolvin D2對比ω-3fatty acids具有更好神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。
【學(xué)位單位】:蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】:博士
【學(xué)位年份】:2018
【中圖分類】:R651.1
【部分圖文】:

腦損傷,內(nèi)源性,大鼠,再灌注


圖 1 I/R 條件下大鼠腦組織中內(nèi)源性 RvD2 表達(dá)變化及腦損傷變化。2.1.2實(shí)驗(yàn)分組2(圖 2)成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,所有MCAO/ R組行72h處死,具體如(1)假手術(shù)組:12只,假手術(shù)對照只是不插入尼龍魚線,其余步驟同手術(shù)(2)MCAO/R組:12只,利用線栓法制備MCAO/ R大鼠I/R模型,再灌注后大鼠,灌注取腦。(3)MCAO/R+ vehicle組:12只,利用線栓法制備MCAO / R大鼠I/R模型,后腹腔注射vehicle,再灌注后的72h處死大鼠,灌注取腦。(4)MCAO/R + RvD2 (25 ng/kg)組:12只,利用線栓法制備MCAO / R大鼠建模成功后腹腔注射RvD2 (25 ng/kg),再灌注后的72h處死大鼠,灌注取腦(5)MCAO/R + RvD2 (50 ng/kg)組:12只,利用線栓法制備MCAO / R大鼠建模成功后腹腔注射RvD2 (50 ng/kg),再灌注后的72h處死大鼠,灌注取腦

檢測指標(biāo),實(shí)驗(yàn)動物,情況


圖 2 第一部分實(shí)驗(yàn)動物分組情況及檢測指標(biāo)。外源性注射不同劑量RvD2,大鼠I/R腦損傷變化。2.2 MCAO / R大鼠I/R模型的制作2.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備SD大鼠,安爾碘,天平,1ml、2ml、5ml注射器,托盤,500ml容器+輸液管,10%水合氯醛,4%多聚甲醛,0.9%生理鹽水,外科手術(shù)器械一套(組織剪、持針器、鑷子、紋式血管鉗、顯微血管鉗、顯微鑷、無損傷動脈夾);5-0及1號絲線,棉球、紗布,操作臺,綁鼠板,無影燈。2.2.2 手術(shù)步驟(1)10%水合氯醛(藥物效量:4ml/kg)對SD大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。(2)麻醉成功后,將大鼠仰臥于操作臺上,頸部去毛備皮,安爾碘常規(guī)消毒。(3)取SD大鼠沿正中線頸部切開后暴露右側(cè)頸動脈CCA,分離右側(cè)頸外動脈ECA,并在遠(yuǎn)端結(jié)扎其分支。

時間點(diǎn),大鼠,內(nèi)源性,死亡率


結(jié) 果的存活率全部存活,MCAO / R 構(gòu)建大鼠 I/R 組,部分大鼠會因大腦中停止而死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì),實(shí)驗(yàn)分組 1 MCAO / R 構(gòu)建大鼠 I/R 模4/50 大鼠),實(shí)驗(yàn)分組 2 MCAO / R 構(gòu)建大鼠 I/R 模型組死亡率為組平均死亡率 16.9%(22/130 大鼠)。大鼠若死亡隨機(jī)補(bǔ)足每組 條件下,不同時間點(diǎn)大鼠腦組織中內(nèi)源性 RvD2 的表達(dá)變化ELISA 技術(shù)檢測正常喂養(yǎng)條件下,不同時間點(diǎn)大鼠腦組中內(nèi)源分析結(jié)果顯示(圖 3):與 sham 組相比,MCAO/R 各組內(nèi)源(P<0.01);而在大鼠 I/R 條件下,48h,內(nèi)源性 RvD2表達(dá)達(dá)峰值(性 RvD2 表達(dá)明顯下降(P<0.05)。
【參考文獻(xiàn)】

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1 Kai Sun;Jingyu Fan;Jingyan Han;;Ameliorating effects of traditional Chinese medicine preparation, Chinese materia medica and active compounds on ischemia/reperfusion-induced cerebral microcirculatory disturbances and neuron damage[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年01期



本文編號:2841623

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