研究背景:乳腺癌是世界3大癌癥之一,是女性最常見的惡性腫瘤,高發(fā)病率地區(qū)可達每8-10位女性中就有1位罹患乳腺癌。癌細胞的無限增殖特性是乳腺癌一切惡性特征的生物學(xué)基礎(chǔ),而這一永生特性的維持需要多種分子生物學(xué)機制參與。ZEB1是一種E-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,參與多種癌基因表達的調(diào)控。以往對ZEB1的研究側(cè)重于它對乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)以及對腫瘤遷移侵襲特性的調(diào)節(jié)。隨著研究的深入,越來越多的證據(jù)顯示ZEB1也參與腫瘤細胞增殖凋亡特性的調(diào)控。ZEB1在乳腺癌中參與細胞增殖調(diào)節(jié)鮮見報道,且具體的調(diào)控機制亦尚未闡明。研究目的:探究ZEB1在乳腺癌細胞中對細胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)方式,驗證ZEB1-hTERT這一通路是否在腫瘤細胞增殖調(diào)控中起到作用,以及探討二者之間相互作用的具體分子機制。研究方法:對133例乳腺癌組織及癌旁組織提取物進行qRT-PCR檢測ZEB1和hTERT在m RNA水平的表達,免疫組織化學(xué)檢測乳腺癌組織中ZEB1和hTERT在蛋白水平的表達,驗證二者之間的相關(guān)性。使用小干擾RNA技術(shù)在乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7中人為降低ZEB1表達,或使用過表達質(zhì)粒載體上調(diào)ZEB1的表達,qRT-PCR和western blot檢測hTERT在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達變化,驗證ZEB1對hTERT的調(diào)控作用。升高或降低ZEB1表達后對端粒酶的活性和兩種乳腺癌細胞中染色體末端端粒長度進行檢測,研究ZEB1調(diào)控hTERT表達所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。通過qRT-PCR和western blot檢測驗證ZEB1的上調(diào)能否抵消hTERT下調(diào)所引起的表達水平的下降,恢復(fù)hTERT在m RNA和蛋白水平的表達。MTT實驗和流式細胞凋亡實驗分別用于檢測同時下調(diào)hTERT和上調(diào)ZEB1后MDA-MB-231和MCF-7細胞增殖狀態(tài)和凋亡狀態(tài)與單獨敲除hTERT后細胞狀態(tài)的改變之間的差異。染色質(zhì)免疫共沉淀及雙熒光素酶報告基因檢測用于分析ZEB1與hTERT啟動子的結(jié)合情況。組織樣本及細胞樣本的DNA提取物進行堿基測序,用于檢測hTERT啟動子區(qū)域堿基突變情況。免疫共沉淀實驗用于檢測ZEB1和YAP的結(jié)合情況。染色質(zhì)免疫共沉淀及雙熒光素酶報告基因檢測用于分析YAP與hTERT啟動子的結(jié)合情況。構(gòu)建啟動子截斷熒光素酶報告基因質(zhì)粒,用于檢測ZEB1和YAP的相互作用和探究二者在調(diào)控hTERT轉(zhuǎn)錄過程中的相互作用。qRT-PCR和western blot檢測YAP的表達變化對hTERT的m RNA和蛋白表達水平的調(diào)控。裸鼠皮下異種移植物造模用于分析ZEB1在機體內(nèi)對hTERT的調(diào)控作用。qRT-PCR和免疫組化用于檢測異種移植物中ZEB1和hTERT表達水平之間的聯(lián)系。研究結(jié)果:在乳腺癌組織中,ZEB1的表達和hTERT的表達在m RNA和蛋白水平呈明顯正相關(guān)。在乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7中ZEB1對hTERT的表達有正向調(diào)控作用。ZEB1的過表達可以誘導(dǎo)端粒酶活性升高,維持端粒長度。ZEB1表達升高可以抵消si RNA引起的hTERT表達水平降低、細胞增殖減弱和細胞凋亡增多。分子作用機制研究結(jié)果顯示,ZEB1可以與YAP形成轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體,在乳腺癌細胞中結(jié)合于hTERT啟動子-1051—-957bp處,發(fā)揮促啟動子轉(zhuǎn)錄活性作用。在裸鼠異種移植物模型中,ZEB1對hTERT表達的調(diào)控作用依然存在。研究結(jié)論:本研究首次證實了ZEB1-hTERT通路在乳腺癌細胞增殖調(diào)控中發(fā)揮作用。ZEB1可以募集共刺激因子YAP形成蛋白復(fù)合體,結(jié)合于hTERT啟動區(qū)域促進hTERT轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)hTERT的表達,從而促進乳腺癌細胞的增殖,抑制細胞凋亡。以往的研究已證實ZEB1可參與乳腺癌EMT的誘導(dǎo),調(diào)節(jié)腫瘤細胞的遷移侵襲特性,本研究證實ZEB1也參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖凋亡,對ZEB1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用進行了補充。這為ZEB1作為一個全面參與乳腺癌調(diào)控的分子,成為乳腺癌新的治療靶點提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【文章目錄】：
前言
    參考文獻
中文摘要
Abstract
材料與方法
實驗結(jié)果
    第一部分：hTERT的表達在乳腺癌中與 ZEB1 的表達水平呈正相關(guān)
        結(jié)果
            1.hTERT的表達在乳腺癌中與ZEB1的表達水平呈正相關(guān)
            2.ZEB1在乳腺癌細胞中促進hTERT的表達,同時增強端粒酶活性
        小結(jié)
    第二部分：ZEB1增強端粒酶的活性，促進乳腺癌細胞的增殖
        結(jié)果
        小結(jié)
    第三部分：ZEB1促進hTERT啟動子轉(zhuǎn)錄活性，E-box結(jié)合序列可能未發(fā)揮作用
        結(jié)果
        小結(jié)
    第四部分：ZEB1與共激活因子 YAP 結(jié)合發(fā)揮促hTERT轉(zhuǎn)錄作用
        結(jié)果
        小結(jié)
    第五部分：ZEB1在機體內(nèi)對 hTERT的表達呈正向調(diào)控作用
        結(jié)果
        小結(jié)
討論
參考文獻
綜述
    參考文獻
致謝
附錄1 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄
附錄2 英文縮略詞表

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Minal Garg;;Epithelial-mesenchymal transition-activating transcription factors-multifunctional regulators in cancer[J];World Journal of Stem Cells;2013年04期

本文編號：2841750