創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)一直是一個困擾世界的醫(yī)療問題,TBI輕重程度往往決定患者的預后情況。重型TBI患者均可出現(xiàn)交感神經興奮,主要表現(xiàn)為血壓、心率和血漿兒荼酚胺水平升高,并引發(fā)嚴重的顱外器官功能障礙,給患者帶來不良的臨床結局和高昂的醫(yī)療支出。目前TBI后發(fā)生交感神經興奮的病理生理學機制尚不清楚,為臨床治療帶來極大困難。既往研究表明,下丘腦室旁核(The Hypothalamic Paraventricular Nucleus,PVN)是中樞神經系統(tǒng)內調節(jié)交感神經活動的關鍵部位。PVN內的促炎細胞因子水平升高與交感神經興奮的發(fā)生有重要關系。Toll樣受體4(Toll Like Receptor 4,TLR4)是細胞表面的模式識別受體,能夠通過與環(huán)境中的配體結合啟動細胞內信號通路激活核因子-κB(Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer Of Activated B cells,NF-κB)。激活的NF-κB復合物進入細胞核可以調控TNF-α、IL1-β等多種促炎細胞因子的基因轉錄,刺激PVN神經元引起交感神經系統(tǒng)興奮。研究表明,TBI會導致小膠質細胞活化,而中樞神經系統(tǒng)內TLR4主要表達在小膠質細胞上。因此本研究提出以下假設:(1)在顱腦損傷后,PVN內活化的小膠質細胞TLR4表達升高;(2)TLR4能夠激活下游的NF-κB通路,產生大量TNF-α和IL-1β等炎癥因子,改變了PVN內分子環(huán)境,導致交感神經興奮的發(fā)生。為驗證以上假設,本研究擬通過以下實驗,(1)利用大鼠液壓打擊模型,明確血壓、心率、心率變異性和血漿去甲腎上腺素的水平,并探索交感神經興奮隨時間的變化規(guī)律;(2)選取最佳時間點觀察下丘腦PVN內小膠質細胞的活化以及TLR4在小膠質細胞上的共表達情況;并通過PCR、Western blot和免疫組化方法檢測PVN內TLR4、NF-κB、TNFα和IL-1β的水平;(3)分別對TLR4進行抑制和激動,明確TLR4與TBI大鼠交感興奮的關系。探索TBI后TLR4對交感神經興奮性的調控作用,為TBI后交感興奮的發(fā)病機制提供理論依據和新的治療靶點。第一章大鼠壓液打擊模型的建立與交感神經興奮性檢測目的:建立大鼠顱腦損傷模型,明確TBI后發(fā)生交感神經興奮,并探索交感神經興奮隨時間的變化規(guī)律。方法:70只大鼠麻醉鉆孔固定后,經液壓打擊儀2.1-2.3ATM壓力打擊。存活的55只大鼠中,隨機選取42只進入血漿去甲腎上腺素實驗組,進行各時間點檢測;隨機選取6只進入心率、平均動脈壓和心率變異率實驗組,進行各時間點檢測;隨機選取6只進入腦組織HE染色實驗組。隨機選取18只平均分配作為各實驗組的對照。1.大鼠液壓打擊后,死亡率達21.4%神經反射出現(xiàn)不同程度下降或消失。平均呼吸暫停時間(18.62±2.82)s。2.液壓打擊后,顱骨鉆孔處腦組織存在部分缺損。HE染色提示腦內各部位均有不同程度的神經元變性、死亡。白質內可見神經的軸突損傷,髓鞘斷裂。損傷處大量的神經元死亡及小膠質細胞活化,形成格子細胞。血管與腦組織間隙增加,細胞體積增大。3.大鼠心率、平均動脈壓、心率變異率及血漿去甲腎上腺素水平,在TBI后24小時開始呈現(xiàn)先升高后降低的變化規(guī)律,傷后第3天達到最高值,此時各組均存在統(tǒng)計學差異。結論:1.液壓打擊后大鼠的死亡主要原因是呼吸暫停。通過制作大鼠液壓打擊模型,造成大鼠神經功能下降、神經元變性壞死,創(chuàng)造了腦組織損傷條件。2.TBI造成了大鼠交感神經興奮。TBI后大鼠心率、平均動脈壓、心率變異率及血漿去甲腎上腺素等指標隨時間變化呈現(xiàn)相似的規(guī)律和趨勢。3.TBI后24小時內大鼠交感神經興奮性出現(xiàn)升高,然后繼續(xù)上升至損傷后第3天附近達到最大興奮程度,隨后交感神經興奮性呈波動下降趨勢。4.TBI后第3天是交感神經興奮性研究的最佳時間點。第二章TBI對PVN內小膠質細胞活化及TLR4-NF-κB通路的影響目的:明確TBI對PVN內小膠質細胞、TLR4、NF-κB和促炎細胞因子的表達影響。方法:隨機選取經液壓打擊后存活的大鼠24只,作為實驗組平均分配至四個亞組進行免疫熒光、免疫組化、Western blot和PCR檢測,隨機選取24只大鼠作為各亞組的對照。損傷后第72小時斷頭取腦,免疫熒光檢測小膠質細胞Iba-1和TLR4在PVN內及PVN旁組織的共表達情況。PCR檢測TLR4在PVN內及PVN旁組織的mRNA水平,以及PVN內TNFα和IL-1β的mRNA水平。Western blot檢測NF-κBp65亞基、TNFα和IL-1β的蛋白水平。免疫組化方法檢測PVN內及PVN旁組織的NF-κB水平。結果:1、TBI大鼠PVN內Iba-1、TLR4和NF-κB表達量較對照組增加,差異具有統(tǒng)計學意義。實驗組和對照組大鼠的PVN旁組織內TLR4、NF-κB和Iba-1表達水平較低。2、TBI大鼠PVN內TNFα和IL-1β的mRNA和蛋白表達水平較對照組升高,差結果:異具有統(tǒng)計學意義。結論:1、TBI后大鼠PVN內小膠質細胞活化伴隨TLR4表達上調、NF-κB、TNF-α和IL1-β含量增加。2、大鼠下丘腦PVN是調控交感神經興奮的關鍵部位,增加的炎癥因子由PVN內產生。3、TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平與交感神經興奮存在相關性。第三章TLR4對TBI大鼠PVN內NF-κB通路及交感神經興奮性的影響目的:明確TLR4對PVN內NF-κB促炎細胞因子和交感興奮的調控作用。方法:隨機選取經液壓打擊后存活的大鼠60只,TBI與TBI+TAK-242組各30只,每組平均分配至五個亞組進行生命體征、血漿NE、免疫組化、ELISA和PCR檢測。隨機選取大鼠60只,Control與LPS組各30只,每組平均分配至五個亞組進行生命體征、血漿NE、免疫組化、ELISA和PCR檢測。損傷后第72小時斷頭取腦,處死前24小時分別給予LPS組和TBI+TAK-242組LPS、TAK-242注射。PCR檢測TLR4在PVN內的mRNA水平。ELISA檢測PVN內TNFα和IL-1β的水平。免疫組化方法檢測PVN內的NF-κB水平。結果:1、應用LPS后,大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平較對照組均有明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義。TBI大鼠應用TAK-242后TBI大鼠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL1-β水平有所下降,差異有統(tǒng)計學意義。2、應用LPS后,大鼠HR、MAP和血漿NE水平較相應對照組均有明顯升高,而SDNN、SDNN Index則明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義。TBI大鼠應用TAK-242后TBI大鼠HR和血漿NE水平有所下降,差異有統(tǒng)計學意義。結論:1、TLR4可以通過調控NF-κB和促炎細胞因子水平,調節(jié)交感神經興奮程度。2、TBI可通過TLR4調節(jié)血壓升高,但TLR4的表達可能不是維持血壓升高的原因。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

室旁核內 Toll 樣受體 4 對顱腦損傷后大鼠交感神經興奮性的影響及機制研究四、實驗結果（一）液壓打擊大鼠模型的制備與神經功能情況改變實驗前 70 只大鼠作為實驗組通過液壓打擊模型，共有 15 只大鼠死亡，死亡率21.4%。其中 14 只大鼠為打擊后 2 小時內死亡，1 只為第二天死亡。所有大鼠實驗前均無神經功能障礙，神經反射活動正常。經液壓打擊后，大鼠出現(xiàn)不同程度的肢體抽搐，角膜反射以及翻正反射等神經反射下降或消失。平均呼吸暫停時間(18.62±2.82)s，在 6 小時內存活大鼠神經反射恢復正常。

大鼠腦組織HE染色（10x）情況

圖 3 大鼠腦組織 HE 染色（40x）情況A、C、E 為對照組大鼠腦組織染色，B、D、F 為液壓打擊大鼠腦組織染色。（三）顱腦損傷大鼠血壓、心率、心率變異率及血漿去甲腎上腺素水平變化規(guī)律大鼠心率在 TBI 后 24 小時已出現(xiàn)升高，至傷后第 3 天達到最高值，較對照組有明顯升高（423.794±11.593 vs 382.235±12.229, P<0.001）。此后心率水平逐漸下降，至第 6 天稍有升高（409.358±12.972 vs 382.398±16.256, P<0.01）然后在第 7 天繼續(xù)呈下降趨勢。其中，對照組的心率情況較為穩(wěn)定，組間無統(tǒng)計學差異，具有比較意義。見圖 4.大鼠平均動脈壓同樣在 TBI 后 24 小時出現(xiàn)升高，并繼續(xù)上升至傷后第 3 天達到最高值，較對照組有明顯升高（107.541±7.620 vs 130.948±5.797, P<0.001）。從第 4 天起血壓水平逐漸下降，中間稍有波動但總體呈下降趨勢。除傷后第 24 小時外，其余各時間點上實驗組血壓水平較對照組都有顯明升高，具有統(tǒng)計學意義。對照組的血壓
【參考文獻】

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1 孫安陽,李德興;腎血管性高血壓大鼠腦室注射γ-氨基丁酸的心血管效應(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;1994年02期

本文編號：2840398