增生性瘢痕是傷口過度愈合導(dǎo)致的一種病理性纖維化疾病,其組織學(xué)特點為成纖維細胞的過度增殖及細胞外基質(zhì)的過度沉積,常伴有瘙癢及疼痛,嚴(yán)重影響美觀并可能導(dǎo)致功能障礙,是整形外科中仍未解決的重要難題。盡管國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對瘢痕的形成及發(fā)展過程進行了深入的研究,但其具體的發(fā)病機制仍未被完全闡明。據(jù)統(tǒng)計,壓力療法作為一種非侵入式的治療方法在60%~85%的患者身上獲得成功,但對瘢痕的壓力治療均基于臨床經(jīng)驗,而且由于增生性瘢痕產(chǎn)生緩慢、隨機性強、人體樣本較難連續(xù)獲取等特點,所以對壓力治療增生性瘢痕的分子機制的認識尚沒有明確的科學(xué)數(shù)據(jù)。利用動物模型闡明增生性瘢痕的發(fā)病機理及發(fā)展過程,揭示壓力治療增生性瘢痕的生物學(xué)機制,不僅使增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展過程的連續(xù)研究成為可能,同時可以為臨床上壓力療法的應(yīng)用提供理論依據(jù)及指導(dǎo)。基于此,本課題選用巴馬小型豬作為研究對象,通過制造背部取皮傷建立增生性瘢痕動物模型并進行加壓治療。結(jié)合組織學(xué)分析手段和分子生物學(xué)實驗方法對增生性瘢痕形成及發(fā)展過程和壓力治療過程展開系統(tǒng)的、連續(xù)的在體研究,從外觀水平、組織學(xué)水平、轉(zhuǎn)錄組水平及蛋白水平分析增生性瘢痕的產(chǎn)生機理、發(fā)展過程及壓力治療的潛在分子機制。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)成功建立了增生性瘢痕動物模型。選擇巴馬小型豬作為研究對象,利用電動取皮刀在其背部制造深及真皮層的取皮傷,使其自然上皮化而愈合。在取皮后第14、30、60、90和120天時觀察傷口的愈合情況以及瘢痕的形成情況,并提取皮膚組織樣本,行HE染色和馬松染色,觀察細胞的增殖以及膠原的沉積情況。結(jié)果顯示,取皮后第60天時,形成的瘢痕在原始損傷邊緣范圍內(nèi),明顯比周圍正常皮膚更堅硬,中心呈深紅色,且所有傷口都具有致密、纖維化、凸起但不明顯的外觀,組織切片染色可見細胞增殖明顯、膠原纖維沉積并排列紊亂,確定巴馬小型豬背部取皮傷后形成了增生性瘢痕;(2)壓力治療改善了瘢痕外觀,減緩了瘢痕增生。在取皮后第60天時,利用自制壓力繃帶對巴馬小型豬背部形成的增生性瘢痕進行加壓治療,壓力大小為3.4 kPa(25.5 mmHg),每天24小時持續(xù)加壓不間斷,在取皮后第90天和120天時觀察壓力治療對瘢痕的外觀水平及組織學(xué)水平的影響。結(jié)果顯示,壓力治療減輕了增生性瘢痕的色素沉著,使瘢痕表面變得平整,改善了增生性瘢痕的外觀。組織切片染色可見,成纖維細胞數(shù)量減少,膠原纖維結(jié)節(jié)減少且排列方式變得整齊,幾乎平行于皮膚表面,確定壓力治療具有較好的臨床效果;(3)壓力治療影響了瘢痕動物模型的轉(zhuǎn)錄組表達水平。利用RNA-seq技術(shù)檢測取皮后不同時間點皮膚組織中轉(zhuǎn)錄組水平的表達情況,然后采用生物信息學(xué)分析軟件計算瘢痕形成及發(fā)展過程和壓力治療過程中的基因表達差異,并對差異表達基因(DEGs)進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析,最后通過qRT-PCR驗證測序結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明,加壓治療2個月后DEGs數(shù)目少于加壓治療1個月后的DEGs數(shù)目,但兩組DEGs所富集的GO功能條目類似,包括細胞外基質(zhì)、生長因子結(jié)合及表皮細胞遷移等;且兩組DEGs所富集的KEGG信號通路也類似,包括細胞外基質(zhì)-受體相互作用、蛋白質(zhì)的消化和吸收等信號通路,本結(jié)果確定壓力治療影響了瘢痕動物模型轉(zhuǎn)錄組的表達水平;(4)壓力治療抑制了瘢痕動物模型組織中IGF-1/IGF-1R及其下游PI3K/AKT信號通路的表達�；赗NA-seq數(shù)據(jù),計算取皮后不同時間點皮膚組織中IGF-1/IGF-1R信號通路及其下游MEK/ERK和PI3K/AKT兩條信號通路的轉(zhuǎn)錄組表達水平,qRT-PCR和Western blot分別檢測基因和蛋白的表達水平,探討該信號通路在瘢痕形成及發(fā)展過程和壓力治療過程中發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示,加壓治療后MEK/ERK信號通路表達水平升高,但IGF-1/IGF-1R信號通路及其下游PI3K/AKT信號通路的表達水平顯著降低;(5)壓力治療抑制了瘢痕動物模型組織中細胞外基質(zhì)的表達。基于RNA-seq數(shù)據(jù),計算取皮后不同時間點皮膚組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、I型膠原(Collagen I)、III型膠原(Collagen III)、纖連蛋白(FN)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的轉(zhuǎn)錄組表達水平并進行qRT-PCR驗證,考察VEGF及細胞外基質(zhì)在瘢痕形成及發(fā)展過程中的表達變化以及壓力治療對細胞外基質(zhì)分泌的影響。結(jié)果顯示,壓力治療1個月后明顯抑制了Collagen I、Collagen III、FN和α-SMA的基因表達,但加壓治療2個月后表達有所回升。綜上所述:巴馬小型豬背部取皮傷可以成功建立增生性瘢痕動物模型,IGF-1/IGF-1R及PI3K/AKT信號通路可能在壓力治療增生性瘢痕的過程中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R622
【部分圖文】：

人體皮膚的組織結(jié)構(gòu)

圖 1-2 增生性瘢痕的發(fā)病機制中所涉及的主要生長因子通路的示意圖[30]. 1-2 Schematic diagram of primary growth factor pathways involved in the pathogenehypertrophic scars[30]外基質(zhì)（ECM）代謝異常

前創(chuàng)傷部位進行加壓治療（圖 2-2），并用壓力傳感器測量及時調(diào)整彈力繃帶使壓力值維持在 3.4 kPa（25.5 mmHg）， 2-1 所示。在取皮后不同時間點（14、30、60、90、120 天加壓與未加壓位置。提取的皮膚組織樣本一部分固定于 4%學(xué)切片染色分析；一部分保存于液氮中，用于后續(xù)的分子
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