目的:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年約有l(wèi) 200 000婦女發(fā)生乳腺癌,500000婦女因乳腺癌死亡。北美和歐洲等發(fā)達國家是乳腺癌的高發(fā)區(qū)。據(jù)統(tǒng)計,美國婦女9個人中將有1人在其一生中患乳腺癌。亞洲是乳腺癌的低發(fā)區(qū),但乳腺癌的發(fā)病率逐年升高,且有年輕化趨向。PTBP1屬于heterogeneous nuclear ribonucleoproteins(hnRNPs)家族成員,可在RNA代謝的許多方面發(fā)揮多種功能。PTBP1對于調(diào)控可變剪接、IRES介導(dǎo)的翻譯起始以及提高多種轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性都是至關(guān)重要的。PTBP1細(xì)胞定位和它與多種因子的相互作用決定了其功能的多樣性。已有研究報道與正常組織相比,PTBP1在乳腺癌組織中高表達,在細(xì)胞系檢測中同樣發(fā)現(xiàn)PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系中高表達,PTBP1能促進乳腺癌細(xì)胞的生長和侵襲,但具體機制目前尚不清晰。PTEN-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤有著廣泛而密切的關(guān)系,其失衡不僅促進腫瘤的發(fā)生于發(fā)展,而且可促進腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移,并參與腫瘤的免疫逃逸。自噬作用在腫瘤的進程中也起著重要的作用。機體大約30%的蛋白質(zhì)均可發(fā)生不同形式的磷酸化,其磷酸化位點主要發(fā)生于酪氨酸、絲氨酸與蘇氨酸殘基,蛋白質(zhì)磷酸化的異常往往導(dǎo)致細(xì)胞生命活動的異常,甚至產(chǎn)生細(xì)胞損傷或細(xì)胞癌變。P21活化激酶(P21-activated kinase,PAK)為一類保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶�？杀簧L因子及其他細(xì)胞外信號活化,并通過眾多的下游結(jié)合蛋白或激酶底物,調(diào)節(jié)控制許多生物學(xué)功能,在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞極性調(diào)控、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,特別是在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用。PAK5作為II類PAK的最新發(fā)現(xiàn)且研究最少的成員,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究探討PTBP1對乳腺癌癌細(xì)胞生長,遷移及侵襲的作用及機制,探討PTBP1如何通過PTEN/Akt通路和細(xì)胞自噬影響乳腺癌細(xì)胞的生長,以及PAK5對PTBP1磷酸化作用,為明確乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供依據(jù)。方法:1.驗證PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中的表達:(1)Western blot實驗分析PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系的蛋白表達情況;(2)Western blot實驗分析PTBP1在乳腺癌組織的表達;(3)免疫組織化學(xué)實驗分析PTBP1在乳腺癌組織的表達。2.證實PTBP1在乳腺癌發(fā)展中的重要意義:(1)MTT實驗證實PTBP1對乳腺癌細(xì)胞生長的影響;(2)克隆形成實驗證實PTBP1對乳腺癌細(xì)胞生長的影響;(3)Transwell實驗檢測PTBP1對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響;(4)裸鼠荷瘤實驗證實PTBP1對乳腺癌細(xì)胞生長的影響。3.PTBP1促進乳腺癌細(xì)胞生長的機制研究:(1)Western blot實驗證實PTBP1對PTEN-Akt通路的影響;(2)Western blot實驗證實PTBP1對細(xì)胞自噬的影響;(3)Western blot實驗分析PAK5與PTBP1蛋白表達的相關(guān)性。4.PAK5與PTBP1相互作用的驗證:(1)TNT結(jié)合GST pulldown實驗,證實PAK5與PTBP1在體外直接結(jié)合;(2)免疫共沉淀實驗,證實PAK5與PTBP1的體內(nèi)相互作用;(3)在乳腺癌細(xì)胞中過表達PAK5,Western Blot檢測PAK5對PTBP1蛋白表達的影響;(4)體外激酶分析實驗檢測PAK5對PTBP1的磷酸化影響。結(jié)果:1.驗證PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中的表達:(1)PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系中呈高表達;(2)PTBP1在乳腺癌組織中呈高表達。2.證實PTBP1在乳腺癌發(fā)展中的重要意義:(1)PTBP1能促進乳腺癌細(xì)胞生長;(2)PTBP1促進乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲;(3)PTBP1能促進裸鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的生長。3.PTBP1促進乳腺癌細(xì)胞生長的機制研究:(1)PTBP1通過下調(diào)PTEN激活p-Akt通路;(2)PTBP1抑制細(xì)胞自噬;(3)PTBP1與p-Akt在乳腺癌組織呈強相關(guān)性表達。4.PAK5與PTBP1相互作用的驗證:(1)PAK5與PTBP1能夠在體外直接結(jié)合;(2)PAK5與PTBP1能夠在體內(nèi)相互作用;(3)PTBP1是PAK5新的生理性底物;(4)PAK5能下調(diào)PTBP1表達。結(jié)論:1.PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中均高表達。2.PTBP1通過PTEN/Akt和自噬促進乳腺癌細(xì)胞生長。3.PTBP1為PAK5新的生理性底物。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分：PTBP1通過PTEN/Akt通路和細(xì)胞自噬促進乳腺癌細(xì)胞的生長
    1 前言
    2 實驗材料和方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 細(xì)胞
            2.1.3 臨床病例與動物
            2.1.4 實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 克隆PTBP1基因的全長,構(gòu)建到不同質(zhì)粒載體中
            2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染
            2.2.4 蛋白提取
            2.2.5 Western Blot
            2.2.6 慢病毒轉(zhuǎn)染
            2.2.7 Transwell
            2.2.8 MTT
            2.2.9 細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.2.10 Real-time PCR反應(yīng)
            2.2.11 克隆形成
            2.2.12 裸鼠皮下成瘤實驗
            2.2.13 免疫組織化學(xué)實驗
    3 實驗結(jié)果
        3.1 PTBP1在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中高表達
        3.2 敲低PTBP1乳腺癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建
        3.3 敲低PTBP1抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和遷移侵襲
        3.4 敲低PTBP1抑制乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)生長
        3.5 PTBP1通過PTEN/Akt通路和細(xì)胞自噬促進乳腺癌細(xì)胞的生長
        3.6 PTBP1與p-Akt具有臨床表達相關(guān)性
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分：PAK5與PTBP1的相互作用及調(diào)控
    1 前言
    2 實驗材料和方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 細(xì)胞
            2.1.3 實驗儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 克隆PTBP1基因的全長,構(gòu)建到不同質(zhì)粒載體中
            2.2.2 體外GST-pulldown
            2.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染
            2.2.4 蛋白提取
            2.2.5 Western Blot
            2.2.6 免疫共沉淀
            2.2.7 體外激酶分析驗證蛋白的磷酸化
            2.2.8 Transwell
            2.2.9 慢病毒轉(zhuǎn)染
    3 結(jié)果
        3.1 PAK5在乳腺癌組織中呈高表達
        3.2 PAK5誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT
        3.3 PAK5促進乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲
        3.4 PAK5與PTBP1相互作用的驗證
        3.5 PTBP1是PAK5新的生理性底物
        3.6 PAK5對PTBP1表達的調(diào)控
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷

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