發(fā)布時間：2020-10-02 11:13

　　 目的:椎間盤退變是誘發(fā)腰背痛最主要的原因之一,關于椎間盤退變發(fā)生、發(fā)展的機制尚未明確。近年來,研究發(fā)現(xiàn)SIRT1基因具有調(diào)節(jié)機體代謝、延長壽命及控制細胞分化和再生等多個生物學效應,并在骨關節(jié)炎中起著重要作用。但SIRT1在椎間盤退變中的作用機制及功能尚未明確。因此,本項目我們將建立軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的動物模型,并通過刺針在小鼠尾椎椎間盤建立急性椎間盤退變模型,來探討SIRT1在該退變中的作用和相關機理,從而為椎間盤退變的防治提供新的思路。方法:1、建立軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的動物模型,通過基因工程小鼠繁殖出SIRT1~(+/+)小鼠。在小鼠出生后6周,將其隨機分為兩組(每組10只),將其中一組按75mg/kg的標準腹腔注射10mg/ml的他莫昔芬(每天1次,連續(xù)5天),來特異性敲除軟骨中的SIRT1基因,另一組小鼠未進行任何處理。注射1周后,取兩組小鼠尾尖行熒光定量PCR和普通PCR加電泳,以及椎間盤組織中SIRT1蛋白表達的免疫組化,以鑒定軟骨組織中SIRT1基因的敲除情況。2、通過對SIRT1~(+/+)、SIRT1~(-/-)兩組小鼠尾椎椎間盤進行針刺來建立急性椎間盤退變模型,在術后第2、4、6及8W行X線拍片觀察椎間高度和測量椎間高度指數(shù)(Dise Height Index,DHI)的改變情況。同時分別在術后4W、8W各處死兩組小鼠各5只,取兩組小鼠尾椎組織標本行HE染色、甲苯胺藍染色、Masson染色及潘紅O染色,并對椎間盤組織中I型膠原、II型膠原及AGC進行免疫組化觀察,比較SIRT1基因敲除組與未敲組小鼠椎間盤的退變情況。3、為進一步探討軟骨特異性敲除SIRT1基因?qū)ψ甸g盤退變的影響機制,本研究還對兩組小鼠尾椎進行了Micro-CT掃描,量化椎體骨量體積百分比、骨小梁的數(shù)目、骨小梁的厚度和三維結構的改變。結果:1、SIRT1基因敲除組小鼠大體觀和體重與未敲組無明顯差異,飲食活動正常。通過熒光PCR結果顯示,SIRT1基因敲除組小鼠尾尖軟骨組織中SIRT1mRNA表達量顯著低于未敲除組小鼠(P0.05);SIRT1免疫組化結果顯示,椎間盤組織中SIRT1蛋白免疫組化染色積分SIRT1基因敲除組小鼠顯著低于未敲除組(P0.01),說明成功建立軟骨特異性SIRT1基因敲除動物模型。2、影像學結果顯示,在兩組小鼠中,穿刺組的DHI%均顯著低于不穿刺組(P0.05);在穿刺條件下,SIRT1基因敲除組小鼠的DHI%顯著低于未敲除組(P0.05);在不穿刺條件下,SIRT1基因敲除組小鼠的DHI%也顯著低于未敲組(P0.05)。結果證明穿刺加速小鼠椎間高度的降低;在穿刺或不穿刺條件下,軟骨特異性敲除SIRT1基因敲除均能加速椎間高度的降低。3、椎間盤組織學評分結果顯示:在4W時,SIRT1基因未敲組小鼠中穿刺組評分顯著高于不穿刺組(P0.01);SIRT1基因敲除組小鼠中穿刺組評分也顯著高于不穿刺組(P0.05);在穿刺條件下,SIRT1基因敲除組小鼠評分顯著高于未敲除組(P0.05);在不穿刺條件下,SIRT1基因敲除組小鼠評分顯著高于未敲除組(P0.01)。在8W時,兩組小鼠中穿刺組評分均顯著高于不穿刺組(P0.01);在穿刺條件下,SIRT1基因敲除組小鼠評分顯著高于未敲除組(P0.05);在不穿刺條件下,SIRT1基因敲除組小鼠評分也顯著高于未敲除組(P0.01)。結果證實,穿刺能增加椎間盤組織學評分;在穿刺或不穿刺條件下,軟骨特異性敲除SIRT1基因均能增加椎間盤組織學評分。4、免疫組化積分結果顯示,在術后4W和8W時SIRT1基因敲除組小鼠的穿刺組和不穿刺組椎間盤髓核組織中II型膠原及AGC的免疫組化染色積分均顯著低于SIRT1基因未敲除組(P0.05);在術后4W和8W時SIRT1基因敲除組小鼠穿刺組和不穿刺組尾椎的椎間盤纖維環(huán)中的I膠原的免疫組化染色積分均高于SIRT1基因未敲除組,但僅在術后8W時存在顯著差異(P0.05)。結果證實,穿刺降低小鼠椎間盤中II型膠原、AGC的表達,同時增加I膠原的表達;在穿刺或不穿刺條件下,軟骨特異性敲除SIRT1基因均能降低小鼠椎間盤中II型膠原、AGC的表達,同時增加I膠原的表達。5、Micro-CT結果顯示:SIRT1基因敲除組骨量體積百分比顯著高于未敲除組(P0.05);SIRT1基因敲除組骨小梁數(shù)目顯著高于未敲除組(P0.05);兩組骨小梁厚度相互比較無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:通過本研究測量DHI%、觀察椎間盤組織評分、計算免疫組化染色積分及Micro-CT的實驗結果證實:1、穿刺能加速小鼠椎間盤退變;2、在穿刺條件下軟骨特異性敲除SIRT1基因加速小鼠椎間盤退變;3、在不穿刺條件下軟骨特異性敲除SIRT1基因同樣也能加速小鼠椎間盤退變;4、軟骨特異性敲除SIRT1基因加速小鼠椎間盤退變的可能機制是增加椎體骨小梁數(shù)目和骨密度。本實驗通過利用軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠建立椎間盤急性退變模型,證明了軟骨特異性敲除SIRT1基因加速小鼠椎間盤退變,為今后研究椎間盤退變的防治,提供一種新的思路。
【學位單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R681.53
【部分圖文】：

圖 3. SIRT1 基因小鼠繁殖及分組3、軟骨特異性敲除 SIRT1 基因小鼠出生后 6 周，隨機取 10 只 SIRT1+/+小鼠按 75mg/kg 體重標準腹腔注射10mg/ml 他莫昔芬，每日 1 次，連續(xù)注射 5 天，來敲除軟骨組織中 SIRT1 基因，建立 SIRT1 基因敲除組。4、實驗分組SIRT1 基因未敲除（SIRT1+/+）小鼠動物模型組（n=10）；SIRT1 基因敲除（SIRT1-/-）小鼠動物模型組（n=10）。5、軟骨特異性敲除 SIRT1 基因的鑒定5．1 查詢軟骨特異性敲除 SIRT1 基因表型

結果結 果1、軟骨特異性敲除 SIRT1 基因的鑒定結果結果顯示SIRT1基因未敲除組小鼠SIRT1mRNA表達量為8.08257±1.63958，SIRT1 基因敲除組小鼠 SIRT1 mRNA 表達量為 2.60867±1.11480，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。普通 PCR 的 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結果（圖 4）證實 SIRT1 基因敲除組小鼠椎間盤軟骨終板中 SITR1 基因敲除成功。

圖 5.椎間盤髓核組織免疫組化中 SIRT1 的表達情況，標尺=50um。A 與 B 為 SIRT1-/-小鼠椎間盤退變模型組中 4W 與 8W 組髓核組織中 SIRT1 的表達情；C 與 D 為 SIRT1+/+小鼠椎間盤退變模型組中 4W 與 8W 組髓核組織中 SIRT1 的表達情況。注：黑色箭頭為陽性細胞。

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 黃永燦;呂維加;陸?zhàn)K;;干細胞與椎間盤再生:從基礎到臨床[J];中國矯形外科雜志;2012年14期

2 彭俊;徐建廣;;犬椎間盤經(jīng)皮針刺退變模型的建立[J];中國組織工程研究;2012年24期

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本文編號：2832344