【目的】脊髓損傷臨床修復面臨難題,再髓鞘化是修復的主要瓶頸之一,本課題通過脂質體介導音猥因子(Sonic Hedgehog,SHH)基因轉染大鼠激活態(tài)雪旺細胞,過表達音猥因子并增強激活態(tài)雪旺細胞增殖和表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性,將其移植于損傷局部,探討音猥因子和激活態(tài)雪旺細胞修復脊髓損傷的有效性,并分析兩者促進損傷后軸突髓鞘化的協(xié)同作用及其機制�！痉椒ā矿w外研究1.激活態(tài)雪旺細胞的分離培養(yǎng)、鑒定和基因轉染:選擇出生4-6天SD(Sprague Dawley)大鼠,預結扎坐骨神經(jīng)激活雪旺細胞(Schwann Cells,SCs),1周后切取損傷神經(jīng),分離培養(yǎng)、純化SCs,S100免疫熒光鑒定,保證純度95%,未預結扎坐骨神經(jīng)分離獲得未激活SCs作為對照。pEGFP-N1-SHH表達質粒已經(jīng)構建并進行驗證,脂質體介導pEGFP-N1-SHH和空載質粒pEGFP-N1轉染激活態(tài)雪旺細胞(Activated Schwann Cells,ASCs),流式細胞分選綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)表達陽性細胞。2.細胞活性檢測:流式分選后對數(shù)生長期細胞5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)染色觀察細胞增殖情況,轉染后不同時期酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測SHH因子及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)的表達情況。Ⅰ組為未激活SCs組,Ⅱ組為未轉染的ASCs組,Ⅲ組為轉染空載質粒的ASCs(Vector-ASCs,V-ASCs)組,Ⅳ組為轉染SHH基因的ASCs(SHH-ASCs,S-ASCs)組。體內研究1.大鼠脊髓損傷模型制備及分組:8-10周齡雌性SD大鼠,共計216只,IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)打擊系統(tǒng)制作胸10(Thoracic 10,T10)節(jié)段脊髓打擊模型,A組為DMEM移植組,B組為ASCs移植組,C組為S-ASCs移植組。2.細胞移植和行為學評價:SCI后1周損傷局部細胞移植。SCI后和移植后當天,SCI后每2周到第12周,每組8只,進行BBB評分(Basso,BeattieBresnahan locomotor rating scale)對各組大鼠后肢功能恢復情況進行評估。3.SCI后局部SHH因子表達:SCI后第2、4、8、12周,每組8只,SCI中心5mm節(jié)段,組織蛋白抽提試劑(Tissue Protein Extraction Reagent,T-PER)聯(lián)合超聲裂解提取總蛋白,二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法總蛋白定量,ELISA法測定SHH因子表達水平。4.SCI后局部軸突改變:SCI后第12周,每組8只,SCI中心行神經(jīng)絲蛋白200(Neurofilament Protein 200,NF200)免疫熒光染色,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核染,軸突計數(shù),觀察脊髓損傷局部軸突改變情況。5.損傷局部神經(jīng)細胞增生及分化:SCI后第2、12周,每組8只,SCI中心分別行巢蛋白(Nestin)、少突膠質細胞轉錄因子-2(Oligodendrocyte transcription factor-2,Olig2)(增加損傷中心周圍白質)、膠質纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)免疫熒光染色,DAPI核染,細胞計數(shù),觀察脊髓損傷局部神經(jīng)細胞增殖和分化。6.損傷局部白質及髓鞘變化:SCI后第4、12周,每組8只,SCI中心快藍(Luxol fast blue,LFB)髓鞘染色,計算白質面積比例、髓鞘面積比例,觀察脊髓損傷局部白質、髓鞘變化。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計采用SPSS 20.0軟件完成,數(shù)據(jù)均使用`X±S表示。多組均數(shù)之間采用單因素方差分析法進行顯著性檢驗,并利用LSD法進行多組均數(shù)之間的兩兩顯著性檢驗;兩組均數(shù)之間比較應用t檢驗。以P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義�！窘Y果】體外研究1.細胞增殖觀察:EdU染色發(fā)現(xiàn)Ⅳ組(S-ASCs,26.17±4.03%)染色陽性率最高,Ⅱ組(ASCs,20.41±3.16%)和Ⅲ組(V-ASCs,19.34±2.82%)其次,Ⅰ組(SCs,11.86±2.98%)最低,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.SHH、BDNF和NGF的表達:Ⅰ組和Ⅱ組經(jīng)傳代、Ⅲ組和Ⅳ組經(jīng)流式分選后培養(yǎng)1、2、4、6、8周,不同時期SHH、BDNF和NGF的表達,Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組均高于Ⅰ組,其中Ⅳ組表達水平最高,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。體內研究1.行為學評價:SCI后第2周到第12周各組大鼠后肢功能都有恢復,SCI后第12周實驗結束時,C組(16.13±2.03分)最高,B組(13.50±1.77分)其次,A組(9.25±1.58分)最低,具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。2.SCI后局部SHH因子的表達:SCI后第2、4周,C組表達水平最高,B組其次,A組最低,具有統(tǒng)計學意義(P0.01),第8、12周,3組表達水平比較無統(tǒng)計學意義(P?0.05),基本接近正常大鼠脊髓表達水平。3.SCI后局部軸突改變:SCI后第12周,SCI中心軸突(NF200陽性)計數(shù)C組(55.13±12.16根/視野)最多,B組(23.63±8.75根/視野)其次,A組(10.50±5.58根/視野)最少,具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4.SCI后局部神經(jīng)細胞增生及分化:SCI后第2、12周,SCI中心神經(jīng)干細胞(Nestin~+細胞)、損傷中心和周圍白質少突膠質細胞前體細胞(Olig2~+細胞)計數(shù)C組最多,B組其次,A組最少,具有統(tǒng)計學意義(P0.05),各組內比較,隨時間延長無統(tǒng)計學意義(P?0.05);SCI后第2周,SCI中心星形膠質細胞(GFAP~+細胞)計數(shù)B組和C組多于A組,具有統(tǒng)計學意義(P0.01),至第12周C組最少,具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。5.SCI后局部白質及髓鞘變化:SCI后第4到第12周,各組大鼠白質面積比例基本穩(wěn)定無改變,無統(tǒng)計學意義(P?0.05),白質髓鞘面積比例B組和C組明顯增加,具有統(tǒng)計學意義(P?0.05);兩個時間,白質面積、髓鞘面積比例C組最大,B組其次,A組最小,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)�！窘Y論】1.脂質體介導SHH表達質粒轉染激活態(tài)雪旺細胞可過表達SHH因子,強化激活ASCs,促進細胞增殖,并促進BDNF和NGF的表達,且可維持至轉染后6周以上。2.亞急性期脊髓損傷局部移植SHH基因轉染強化激活的ASCs,比較單純ASCs和DMEM,可以更好的促進大鼠損傷局部軸突髓鞘化、保護軸突,獲得后肢功能的恢復,確定聯(lián)合SHH因子和ASCs移植修復SCI的有效性。3.SHH因子可強化激活ASCs且轉染細胞可成功表達SHH因子,兩者聯(lián)合既提供外源性移植細胞,又激活內源性神經(jīng)細胞,增加神經(jīng)干細胞和少突膠質細胞前體細胞,協(xié)同促進軸突髓鞘化,保護軸突,進一步支持髓鞘化和功能恢復的相關性。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R651.2
【部分圖文】：

的形態(tài)呈現(xiàn)長梭形，2 極居多，也有部分細胞表現(xiàn)為 3 極，極少有ASCs、V-ASCs 和 S-ASCs 3 組和 SCs 組在外形上無明顯差異，也多，但在相同視野下，3 極細胞比未激活 SCs 多，部分區(qū)域可見到的細胞，每代始終形態(tài)上相近。方式上，隨著培養(yǎng)時間的延長，達到一定密度后，SCs 停止增殖，力不佳，而 ASCs、V-ASCs 和 S-ASCs 3 組在相同密度下，仍能繼形態(tài)保持不變，但是 ASCs 和 V-ASCs 經(jīng)歷 8 代后、S-ASCs 經(jīng)歷胞形態(tài)和生長方式上同原代 SCs 基本相同。 染色鑒定 SCs 和 ASCs，純度達到 95% 以上（附錄 3）。U 染色觀察細胞增殖活性生長期細胞 EdU 染色觀察細胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)Ⅳ組（S-ASCs）染（26.17±4.03%），Ⅱ組（ASCs）和Ⅲ組（V-ASCs）其次（20.41±32%，無統(tǒng)計學意義），Ⅰ組（SCs，11.86±2.98%）最低，具有統(tǒng)計.05）（圖 1、附錄 4）。

表 1 培養(yǎng)細胞 SHH 表達（單位：ng/ml）時間（周）Ⅰ組 Ⅱ組 Ⅲ組 Ⅳ組 F1 0.16±0.11 0.47±0.0710.46±0.1011.77±0.09 463.177*2 0.20±0.09 0.58±0.0810.52±0.0811.36±0.08 289.174*4 0.17±0.05 0.61±0.0910.58±0.0911.16±0.09 203.879*6 0.11±0.10 0.70±0.09 0.58±0.07 0.88±0.12 95.736**8 0.11±0.10 0.67±0.1310.61±0.0810.68±0.08160.226***P<0.01；1比較無統(tǒng)計學意義（P 0.05）

表 2 培養(yǎng)細胞 BDNF 表達（單位：ng/ml）時間周）Ⅰ組 Ⅱ組 Ⅲ組 Ⅳ組 F1 0.29±0.1610.54±0.1620.42±0.181,22.92±0.18 447.737*2 0.39±0.13 0.82±0.22 0.62±0.12 2.36±0.24 183.532*4 0.35±0.15 1.06±0.1711.04±0.2412.25±0.18 139.209*6 0.30±0.10 1.43±0.17 1.27±0.09 1.77±0.15 180.941*8 0.26±0.06 1.60±0.251,21.41±0.2111.73±0.192100.461*P<0.01；1,2比較無統(tǒng)計學意義

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 于灝;李崇杰;梁曉旭;沙德峰;魏侃;田芙蓉;姚陽;陳兵;車敏;滕松齡;;調控雪旺細胞遷移能力相關分子通路的初步研究[J];中華手外科雜志;2015年05期

2 崔兆輝;滕元君;姜金;夏亞一;汪靜;安麗萍;馬靖琳;萬麟;;Sonic Hedgehog信號通路在成年大鼠脊髓損傷后的表達[J];中國修復重建外科雜志;2015年05期

3 菅輝玲;黃瑾;程江;高蕊;;脂質體及電穿孔法對大鼠雪旺細胞轉染效率的比較與分析[J];西安交通大學學報(醫(yī)學版);2013年06期

4 李巖峰;勞杰;趙新;李繼峰;高凱鳴;;激活態(tài)雪旺細胞惡性潛能的實驗研究[J];中華手外科雜志;2010年04期

5 何繼銀;勞杰;顧玉東;李繼峰;;激活態(tài)雪旺細胞信號轉導通路的分子構成[J];中華手外科雜志;2008年01期

6 南國新;廖維宏;伍亞民;李紅運;王莉;龍在云;;大鼠脊髓損傷后巢蛋白在脊髓組織中的表達[J];脊柱外科雜志;2007年01期

7 何繼銀;勞杰;蔣良福;顧玉東;趙新;李繼峰;;激活態(tài)雪旺細胞信號轉導通路的初步研究[J];中華手外科雜志;2006年06期

8 馮世慶;周先虎;孔曉紅;陳家童;李暉;侯巍;王沛;郭世紱;;自體激活雪旺細胞移植治療急性脊髓損傷的實驗研究[J];中華骨科雜志;2006年08期

9 何繼銀;勞杰;顧玉東;李繼峰;;應用轉錄因子蛋白/DNA組合芯片技術檢測激活態(tài)雪旺細胞的活性轉錄因子[J];中華手外科雜志;2008年05期

本文編號：2832184