目的探討線粒體CB1受體(mitochondrial cannabinoid type 1 receptor,mtCB1R)在大鼠海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷中對線粒體分裂的影響并初步探討這一保護作用的具體分子學機制。方法原代培養(yǎng)出生24h之內(nèi)的Wistar大鼠海馬神經(jīng)元,培養(yǎng)至第8天時采用隨機數(shù)字表法分為6組。(1)正常組(N組):正常培養(yǎng),不做任何處理;(2)缺血/再灌注組(I/R組):海馬神經(jīng)元缺血缺氧6h后,恢復(fù)血氧供應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)20h,構(gòu)建缺血/再灌注模型;(3)ACEA+缺血/再灌注組(ACEA+I/R組):缺血缺氧6h后立即加入ACEA,終濃度為1μmol/L,恢復(fù)血氧供應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)20h;(4)ACEA+AM251+缺血/再灌注組(ACEA+AM251+I/R組):氧糖剝奪6h結(jié)束后立即加入ACEA和AM251,使其終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L,恢復(fù)至原培養(yǎng)狀態(tài)繼續(xù)培養(yǎng)20h,以此模擬腦缺血/再灌注損傷;(5)ACEA+Hemopressin+缺血/再灌注組(ACEA+Hemo+I/R組):氧糖剝奪6h結(jié)束后,同樣于恢復(fù)血氧供應(yīng)20h時加入ACEA和Hemopressin,終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L;(6)賦形劑組(V+I/R組):于缺血缺氧6h結(jié)束后立即加入二甲基亞砜(DMSO),終濃度0.1%,恢復(fù)血氧供應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)20h。為了確定受體激動劑和抑制劑作用的時間段,將(3)、(4)、(5)、(6)組分別劃分為三個亞組,分別于缺血6h給藥、再灌注20h給藥、缺血/再灌注全程給藥,使用CCK-8試劑盒分別測定三個亞組海馬神經(jīng)元的活性;使用倒置顯微鏡觀察各組海馬神經(jīng)元的形態(tài);激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ca~(2+)的濃度、ROS的含量;透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu);流式細胞儀檢測細胞凋亡率;Western blot檢測凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)、線粒體動力相關(guān)蛋白(dynamin-related protein,Drp1)、分裂蛋白1(Fission 1protein,Fis1),細胞凋亡相關(guān)蛋白細胞色素C(apoptosis related protein cytochrome c,Cytc)和Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase1,ROCK1)的表達。結(jié)果1.在ACEA+I/R組、ACEA+Hemo+I/R組中,與缺血亞組和缺血/再灌注亞組相比,再灌注亞組海馬神經(jīng)元的活性明顯增加(P0.05);在ACEA+AM251+I/R組和V+I/R組中,三個亞組之間神經(jīng)元活性的差異沒有明顯的統(tǒng)計學意義(P0.05);2.與N組相比,I/R組、ACEA+I/R組、ACEA+AM251+I/R組、ACEA+Hemo+I/R組和V+I/R組的細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度、ROS的含量、細胞凋亡率、以及AIF、Drp1、Fis1、Cytc、ROCK1蛋白的表達水平均明顯增加(P0.05);3.與I/R組相比,ACEA+I/R組、ACEA+Hemo+I/R組上述各檢測指標明顯降低(P0.05),ACEA+AM251+I/R組、V+I/R組上述各檢測指標差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);4.與ACEA+Hemo+I/R組相比,ACEA+AM251+I/R組上述各指標明顯增加(P0.05);5.線粒體超微結(jié)構(gòu)方面,N組線粒體結(jié)構(gòu)完整,線粒體外膜平整光滑,可看到清晰的線粒體嵴;I/R組、ACEA+AM251+I/R組和V+I/R組線粒體腫脹、空泡化、線粒體嵴遭到破壞,線粒體外膜模糊不清;與I/R組相比,ACEA+I/R組、ACEA+Hemo+I/R組線粒體的損害程度均明顯降低,僅有少量空泡化,雖不具備典型的線粒體結(jié)構(gòu),但線粒體嵴和線粒體外膜仍依稀可見。結(jié)論線粒體CB1受體可通過降低細胞內(nèi)ROS的含量來減少細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度和ROCK1的表達,阻斷線粒體分裂的啟動,并最終減輕海馬神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R614
【文章目錄】：
摘要
abstract
引言
第一章 材料與方法
    1.1 實驗材料
        1.1.1 實驗動物
        1.1.2 實驗材料與試劑
        1.1.3 主要儀器與設(shè)備
    1.2 實驗方法
        1.2.1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)
        1.2.2 氧糖剝奪模型的建立
        1.2.3 實驗分組
        1.2.4 CCK-8檢測細胞的活性
        1.2.5 細胞內(nèi)鈣離子濃度的測定
        1.2.6 測定細胞內(nèi)活性氧的含量
        1.2.7 流式細胞儀測定細胞凋亡率
        1.2.8 觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)
        1.2.9 Westernblot檢測線粒體分裂和細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
        1.2.10 統(tǒng)計學分析
第二章 實驗結(jié)果
    2.1 海馬神經(jīng)元的活性
    2.2 海馬神經(jīng)元生長形態(tài)的觀察
    2.3 細胞內(nèi)鈣離子的濃度
    2.4 .細胞內(nèi)ROS的含量
    2.5 流式細胞儀測定細胞的凋亡率
    2.6 透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)
    2.7 線粒體分裂及細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達
第三章 討論
第四章 結(jié)論
參考文獻
綜述
    綜述參考文獻
攻讀學位期間的研究成果
致謝

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本文編號：2831512