一、研究背景燒傷創(chuàng)面由于存在大量的壞死和變性組織,細菌定植不可避免。革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌菌、大腸埃希菌、克雷伯桿菌等)引起的感染有逐漸增多的趨勢。非受體酪氨酸激酶BMX(bone marrow tyrosine kinase on chromosome X)簡稱骨髓激酶X,是Tec家族成員之一。Tec家族激酶是近年來國內(nèi)外研究的“明星蛋白”,是非受體酪氨酸激酶第二大家族。BMX激酶最初發(fā)現(xiàn)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。它廣泛表達于骨髓造血細胞、淋巴細胞、上皮細胞及內(nèi)皮血管細胞和某些惡性腫瘤細胞(前列腺癌、乳腺癌和腎細胞癌等),并參與炎癥反應(yīng)和多種細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在細胞免疫、發(fā)育、增殖和凋亡過程中起著重要作用。近年來研究表明,BMX激酶與一些慢性炎癥性疾病、免疫系統(tǒng)疾病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)和創(chuàng)傷(腦再灌注損傷)等的發(fā)生相關(guān)。巨噬細胞存在于所有組織中,并在發(fā)育,體內(nèi)平衡,組織修復(fù)和免疫中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞作為固有免疫的重要組成部分,在許多組織中有重要的作用,在不同的組織中巨噬細胞命名不同,包括小膠質(zhì)細胞,組織細胞,破骨細胞,肺泡巨噬細胞,枯否細胞等單核-巨噬細胞系統(tǒng)是重要的抗原遞呈系統(tǒng),兩者(單核細胞為巨噬細胞前體)有不同的抗原識別與遞呈能力,巨噬細胞通過微絲參與的胞吞作用中的吞噬作用,激活特異性免疫系統(tǒng)。研究表明革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素在創(chuàng)面感染以及膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中都有重要作用,本實驗以巨噬細胞系RAW264.7細胞為實驗材料,用大腸桿菌的LPS誘發(fā)細胞炎癥反應(yīng),并用特異性抑制劑BMX-IN-1進行干預(yù),觀察非受體酪氨酸激酶BMX對LPS刺激巨噬細胞分泌促炎性細胞因子TNF-α和吞噬功能的影響及其可能分子機制,以進一步闡明在燒傷后天然免疫巨噬細胞在炎癥反應(yīng)中作用,并對燒傷后感染防治提供意見。二、研究目的探討非受體酪氨酸激酶BMX對LPS刺激巨噬細胞分泌促炎性細胞因子TNF-α分泌和吞噬大腸桿菌的影響。三、研究內(nèi)容第一部分非受體酪氨酸激酶BMX在炎癥環(huán)境下表達的時間效應(yīng)巨噬細胞系RAW264.7制成單細胞懸液,培養(yǎng)于48孔板,1*106/孔。實驗分組:0min組、15min組、30 min組、60 min組和120 min組。10ng/ml LPS刺激,不同時間梯度,流式細胞術(shù)檢測TNF-α的分泌量,以及Western blot法檢測P-BMX蛋白表達。第二部分非受體酪氨酸激酶BMX在LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌促炎性細胞因子TNF-α產(chǎn)生中的作用及信號通路巨噬細胞系RAW264.7制成單細胞懸液,培養(yǎng)于48孔板,1*106/孔。實驗分組:空白對照組、LPS組、25μmol/L+LPS組、75μmol/L+LPS組。LPS組用10ng/ml LPS刺激1 h。后2組預(yù)先用適宜劑量的BMX-IN-1處理12h,再用10ng/ml LPS刺激1 h,流式細胞術(shù)檢測TNF-α的分泌量,Western blot法檢測BMX、P-JNK蛋白表達。第三部分非受體酪氨酸激酶BMX在炎癥環(huán)境下對巨噬細胞吞噬能力的影響巨噬細胞系RAW264.7制成單細胞懸液,培養(yǎng)于48孔板,1*106/孔。搖菌過夜,E.coli帶綠色熒光,分光光度計測OD值。RAW264.7細胞:E.coli=1:50。實驗分組:空白對照組、LPS組、75μmol/L+LPS組。75μmol/L+LPS組預(yù)先用75μmol/LBMX-IN-1處理12h,LPS組和75μmol/L+LPS組用LPS刺激2小時,三組同時加入等量的E.coli吞噬兩小時。流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞對大腸桿菌的吞噬百分率。四、研究結(jié)果第一部分非受體酪氨酸激酶BMX在炎癥環(huán)境下表達的時間效應(yīng)10ng/ml LPS刺激(0、15、30、60、120 min),流式細胞術(shù)檢測到TNF-α(7.96%、25.93%、42.61%、53.63%、70.71%)。10ng/ml LPS刺激15min,Western blot可見P-BMX條帶最亮。第二部分非受體酪氨酸激酶BMX在LPS誘導(dǎo)巨噬細胞分泌促炎性細胞因子TNF-α產(chǎn)生中的作用及信號通路(1)Graph Pad Prism軟件單因素方差分析,75μmol/L BMX-IN-1+LPS組和LPS組,q=5.337,P0.01;75μmol/L BMX-IN-1+LPS組和25μmol/L BMX-IN-1+LPS組,q=3.960,P0.05;75μmol/L BMX-IN-1+LPS組和空白對照組,q=21.07,P0.001,均具有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)Western blot可見BMX和P-JNK條帶亮度減弱,并用Image J和Graph Pad Prism軟件做單因素方差分析,BMX/β-Actin,P-JNK/β-Actin結(jié)果一致第三部分非受體酪氨酸激酶BMX在炎癥環(huán)境下對巨噬細胞吞噬能力的影響。在炎癥環(huán)境下,流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞對大腸桿菌吞噬百分率,Graph Pad Prism軟件做單因素方差分析,LPS組和75μmol/L+LPS組,q=0.2535,P0.05,無統(tǒng)計學(xué)意義。五、研究結(jié)論(1)非受體酪氨酸激酶BMX在炎癥反應(yīng)中可能通過JNK途徑,促進LPS刺激巨噬細胞分泌促炎性細胞因子TNF-α。(2)非受體酪氨酸激酶BMX對LPS刺激巨噬細胞的吞噬功能沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R644
【文章目錄】：
英文縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分：在炎癥環(huán)境下非受體酪氨酸激酶BMX表達的時間效應(yīng)
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
第二部分：非受體酪氨酸激酶BMX在LPS誘導(dǎo)巨噬細胞促炎性細胞因子TNF-α產(chǎn)生中的作用
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
第三部分：非受體酪氨酸激酶BMX在炎癥環(huán)境下對巨噬細胞吞噬能力的影響
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
參考文獻
全文小結(jié)
附錄
致謝
綜述
    參考文獻

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本文編號：2829720