發(fā)布時(shí)間：2020-09-27 17:57

　　 目的:探討膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3、ANXA3)在骨肉瘤細(xì)胞系HOS與成骨細(xì)胞系中的表達(dá)差異及意義,尋求針對骨肉瘤靶向治療的新方法。方法:首先應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光證實(shí)ANXA3是否在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá),再采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western blot法分別檢測ANXA3在成骨細(xì)胞系及骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS細(xì)胞中的表達(dá)水平,再通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染到HOS細(xì)胞系中,下調(diào)HOS細(xì)胞系中ANXA3的表達(dá)。將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HOS細(xì)胞6小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入HOS細(xì)胞情況,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞,提取細(xì)胞中總蛋白后通過Western blot法檢測轉(zhuǎn)染48小時(shí)后HOS細(xì)胞中ANXA 3的蛋白表達(dá)情況,確定ANXA3在骨肉瘤細(xì)胞系HOS中表達(dá)下調(diào),再通過流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后HOS細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果:1.通過激光共聚焦顯微鏡觀察到ANXA3在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá);2.通過RT-PCR、Western blot檢測成骨細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞中ANXA3表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)ANXA3在骨肉瘤細(xì)胞系HOS及U2OS中RNA水平和蛋白表達(dá)水平均較成骨細(xì)胞系顯著升高、而HOS中ANXA3的水平升高更明顯;3.將3種si RNA轉(zhuǎn)染至HOS細(xì)胞系后,通過Western blot檢測HOS細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組ANXA3表達(dá)均明顯下調(diào);4.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后HOS細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后各組凋亡率較轉(zhuǎn)染前均明顯增加。結(jié)論:ANXA3在骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá),下調(diào)HOS細(xì)胞中ANXA3的表達(dá)可使其凋亡增加。
【學(xué)位單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R738.1
【部分圖文】：

（90%培養(yǎng)基+10%DMSO 或 90%血清+10%DMSO）均勻吹散細(xì)胞，用移液器輕輕移入準(zhǔn)備好的凍存管中。用封口膜封裹瓶口并標(biāo)記好，依次放入4 ℃ 30min、-20 ℃ 30min、-80℃過夜（也可直接裝入程序降溫盒后直接放入-80℃冰箱），之后存放于液氮中長久保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)應(yīng)遵循快速復(fù)蘇原則，復(fù)蘇時(shí)應(yīng)盡快在水浴鍋中將細(xì)胞解凍。首先將完全培養(yǎng)基置于恒溫水浴箱（37℃）預(yù)熱 30min 備用。之后取7ml 培養(yǎng)基置于 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。隨后帶保暖手套小心從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞，立即放入 37℃水浴鍋中，并不斷輕輕搖晃，使凍存管中細(xì)胞懸液盡快融化。然后迅速將細(xì)胞懸浮液移入至高壓滅菌過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻散開，在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，隨后將培養(yǎng)瓶放入孵育箱中。

2 結(jié)果2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察膜聯(lián)蛋白 A3 在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞免疫熒光初步檢測細(xì)胞系 HOS、U2OS 中 ANXA3 的達(dá)情況，證實(shí)細(xì)胞中 ANXA3 在骨肉瘤細(xì)胞系中表達(dá)。圖 a 顯示紅色為蛋ANXA3 的表達(dá)情況，圖 b 為細(xì)胞核染，圖 c 為細(xì)胞融合圖，從圖 1、圖中我們可以明顯看出 ANXA3 在細(xì)胞系 HOS、U2OS 中表達(dá)。（圖 2、圖

圖 3. 激光共聚焦顯微鏡檢測骨肉瘤 U2OS 細(xì)胞中 ANXA3 的表達(dá)a. ANXA3 表達(dá)情況;b.細(xì)胞核染色;c.細(xì)胞融合Figure 3. Laser confocal microscopy to detect ANXA3 expression in osteosarcoma U2OS cellsa.ANXA3 expression; b.Nuclear staining; c.Cell fusion2.2 RT-PCR 檢測膜聯(lián)蛋白 A3 在成骨細(xì)胞及骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)通過細(xì)胞系 HOS、U2OS 的細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，我們得知骨肉瘤細(xì)系中 ANXA3 是表達(dá)的，為了驗(yàn)證成骨細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞系中 ANXA3 的體表達(dá)情況與是否存在差異，本實(shí)驗(yàn)通過 RT-PCR 從基因水平檢測表達(dá)情及是否存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與成骨細(xì)胞對照組相比，HOS 細(xì)胞系U2OS 細(xì)胞系較成骨細(xì)胞組明顯升高，其中在 HOS 細(xì)胞系中升高更明顯

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李朝旭;王銳英;唐際存;;丙戊酸鈉增強(qiáng)γδT細(xì)胞對骨肉瘤的殺傷[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2016年01期

2 李朝旭;王銳英;唐際存;;γδT細(xì)胞對耐甲氨蝶呤骨肉瘤細(xì)胞株U2OS的殺傷作用[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2015年07期

3 李朝旭;王銳英;唐際存;;Ⅰ型IFN體外增強(qiáng)人γδT細(xì)胞對骨肉瘤的殺傷作用[J];中國免疫學(xué)雜志;2014年11期

4 談q

本文編號：2828184