一、研究背景機(jī)體正常的腸粘膜屏障主要由機(jī)械、免疫及生物屏障三部分構(gòu)成,機(jī)械屏障是由腸黏膜上皮細(xì)胞的緊密連接形成的,可阻止細(xì)菌和內(nèi)毒素的侵入;免疫屏障是腸粘膜淋巴組織形成的,通過細(xì)胞免疫和體液免疫作用,阻止致病性抗原對(duì)機(jī)體的傷害;生物屏障是由腸道菌群與腸黏膜緊密結(jié)合形成的,可阻止腸道中條件致病菌的定植和入侵。在正常情況下,由于胃腸道黏膜屏障的保護(hù)作用,機(jī)體免受腸腔內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素的侵襲。而在嚴(yán)重?zé)齻蟮募毙詰?yīng)激反應(yīng)條件下,由于血液的重新分配,腸道極易缺血缺氧。胃腸粘膜由于急性的缺血缺氧導(dǎo)致腸黏膜屏障受到破壞,引發(fā)細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位,從而導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位到血液循環(huán)即腸源性感染的發(fā)生。這也是導(dǎo)致燒傷后SIRS和MODS發(fā)生的重要因素。因此,嚴(yán)重?zé)齻蠓乐文c黏膜屏障的損傷就成為了燒傷研究的熱點(diǎn)之一。目前針對(duì)嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)械屏障和免疫屏障損害的機(jī)理已有較多研究,但是關(guān)于生物屏障損害機(jī)理的研究較少。因此,本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠嚴(yán)重燙傷后腸道菌群發(fā)生的變化,從而了解腸黏膜生物屏障損害的情況,提出針對(duì)性的防治策略;本課題還根據(jù)嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜三個(gè)屏障損傷發(fā)生的機(jī)制,早期喂養(yǎng)對(duì)三個(gè)屏障均有保護(hù)作用的營養(yǎng)物質(zhì),從而證實(shí)嚴(yán)重?zé)齻∪嗽缙谖桂B(yǎng)混合營養(yǎng)劑有助于保護(hù)腸粘膜屏障的完整性。二、研究目的,1.通過對(duì)嚴(yán)重燙傷大鼠的糞便16S r RNA宏基因組測(cè)序,研究嚴(yán)重燙傷后大鼠腸道生物屏障的變化。2.探討早期口服混合腸內(nèi)營養(yǎng)劑對(duì)嚴(yán)重?zé)齻∪四c黏膜屏障的保護(hù)及修復(fù)作用。三、資料和方法1.第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供SD大鼠10只,體重(200~220)g,10只大鼠在燙傷前3天,給予正常喂養(yǎng)(飲水和食物),未予其他處理。分別于燙傷前和燙傷后的前三天,無菌鑷子收集新鮮糞便于無菌便盒內(nèi),分別標(biāo)記為燙傷前和燙傷后。后提取燙傷前后各組糞便dna,pcr擴(kuò)增16srrna(v3-v4)區(qū),運(yùn)用高通量miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因測(cè)序。具體測(cè)序內(nèi)容如下:①大鼠腸道菌群otu(操作分類單元)聚類:根據(jù)序列之間97%的相似性作為閾值,分成otu來分析微生物的多樣性。②物種分類:采用rdpclassifier對(duì)每條序列在門、綱、目、科、屬水平上進(jìn)行物種分類,覆蓋率(其數(shù)值越高,則樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越低)80%為閾值對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類進(jìn)行序列豐度(數(shù)量)計(jì)算,構(gòu)建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣。③alpha多樣性的分析:計(jì)算組內(nèi)各樣本的物種多樣性(richnessindex、shannonindex、ace指數(shù)、chao1指數(shù)),衡量樣本物種多樣性。④beta多樣性分析:分析樣品間的差異,選取具有代表性的序列與16srrna的關(guān)鍵序列進(jìn)行比較,依照多序列隊(duì)列構(gòu)建具有代表性的序列作為節(jié)點(diǎn)的發(fā)育樹,運(yùn)用unifracmetric加權(quán)重(計(jì)算不僅評(píng)估樣本間物種的差異,并且加入了物種豐度(數(shù)量)作為權(quán)重)方式來衡量樣品間的距離、樣品的聚類樹及樣品的pca。統(tǒng)計(jì)運(yùn)用spss16.0對(duì)數(shù)據(jù)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析。2.選擇第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所2013年8月至2014年9月收治且符合納入標(biāo)準(zhǔn)的24例燒傷病人,隨機(jī)將病人分為常規(guī)治療組和早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組,每組各12例。常規(guī)治療組病人于傷后24h內(nèi)起接受常規(guī)治療,早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組于相同時(shí)相點(diǎn)在常規(guī)治療基礎(chǔ)上口服含有谷氨酰胺、益生菌、益生元的混合腸內(nèi)營養(yǎng)劑100ml,連續(xù)喂養(yǎng)7天。分別于入院時(shí)及喂養(yǎng)后第1日、第3日、第7日、第14日、第21日檢測(cè)病人血清二胺氧化酶(dao)、血清降鈣素原(pct),血漿內(nèi)毒素(lps)水平及創(chuàng)面分泌物和血液微生物學(xué)培養(yǎng),觀察傷后21日內(nèi)有無發(fā)生mods。統(tǒng)計(jì)運(yùn)用spss16.0對(duì)數(shù)據(jù)行fisher確切概率法、lsd-t檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析及秩和檢驗(yàn)。四、結(jié)果1.嚴(yán)重燙傷后大鼠腸道生物屏障變化的研究:①otu(操作分類單元)聚類分析:大鼠燙傷前后腸道菌群的otu結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均大于0.05)。說明燙傷前后大鼠腸道菌群的種類組成沒有發(fā)生改變。②物種分類:燙傷前后大鼠腸道菌群的種類豐度(數(shù)量)有明顯差異。其中有益菌厚壁菌門數(shù)量相比較燙傷前明顯減少,致病菌變形菌門數(shù)量相比較燙傷前明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均小于0.05)。說明燙傷后腸道有益菌種數(shù)量減少,致病菌種數(shù)量增多。③alpha多樣性分析:燙傷前和燙傷后兩組樣品組內(nèi)相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均大于0.05)。說明兩組樣品均具有良好的多樣性,也證明了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。④beta多樣性分析:燙傷前后兩組樣品組間各自形成聚類,具有各自的特征。說明燙傷后腸道菌群多樣性發(fā)生了變化,且改變主要體現(xiàn)在物種豐度(數(shù)量)方面。2.嚴(yán)重?zé)齻缙诳诜c內(nèi)營養(yǎng)劑對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)的臨床研究①血清DAO水平:早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人于喂養(yǎng)后第7日、第14日及第21日血清DAO水平均明顯低于常規(guī)治療組(P值均小于0.05);其余時(shí)相點(diǎn)組間結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。②血清PCT水平:早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人于喂養(yǎng)后第7日、第14日血清PCT水平均明顯低于常規(guī)治療組(P值小于0.05或P值小于0.01);其余時(shí)相點(diǎn)組間結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。③血漿LPS水平:早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人血漿LPS水平于喂養(yǎng)后第7日明顯低于常規(guī)治療組(P值小于0.05);其余時(shí)相點(diǎn)組間結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均大于0.05)。④血液和創(chuàng)面微生物培養(yǎng):常規(guī)治療組和早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組血液細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)呈陽性結(jié)果分別有7例、1例,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值小于0.05),且常規(guī)治療組有2例培養(yǎng)出腸道常駐菌。兩組病人創(chuàng)面微生物培養(yǎng)陽性結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值大于0.05)。⑤MODS發(fā)生情況:常規(guī)治療組病人有1例發(fā)生MODS,而早期腸內(nèi)喂養(yǎng)組病人中未發(fā)生MODS。組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值大于0.05)。五、結(jié)論1.嚴(yán)重燙傷后大鼠腸道菌群的種類組成沒有發(fā)生改變,但有益菌厚壁菌門的數(shù)量相比較燙傷前明顯減少,致病菌變形桿菌門的數(shù)量較燙傷前明顯增多,表明大鼠嚴(yán)重燙傷后發(fā)生了腸道菌群紊亂,腸黏膜的生物屏障受損。2.嚴(yán)重?zé)齻∪嗽缙诩佑没旌夏c內(nèi)喂養(yǎng)劑,可保護(hù)和修復(fù)腸黏膜屏障的功能,減輕炎癥反應(yīng),從而降低腸源性感染的發(fā)生,改善嚴(yán)重?zé)齻∪说念A(yù)后。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R644

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