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脂肪細胞的分泌功能影響脫細胞血管支架在動物體內(nèi)鈣化進程的研究

發(fā)布時間:2020-09-18 08:49
   第一部分異種與同種動脈脫細胞血管材料在大鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)及鈣化表現(xiàn)目的:先天性心臟病(Congenital Heart Disease,CHD)是最常見的先天性出生缺陷,隨著我國放開二胎政策以及產(chǎn)檢、手術(shù)水平的增加,預(yù)計先心病患兒數(shù)量逐年增多。CHD常需要應(yīng)用不同材質(zhì)、不同口徑的血管材料進行手術(shù)治療,然而目前市面上的血管或瓣膜材料都會在患者體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)從而鈣化衰敗。本研究期望探索有效的脫細胞血管材料的建造方法。通過大鼠皮下模型,來評價同種脫細胞血管材料和異種脫細胞血管材料在動物體內(nèi)的炎癥反應(yīng),以及鈣化情況,從而初步了解兩種材料引起機體免疫反應(yīng)及鈣化的相關(guān)性。方法:取供體大鼠的頸動脈材料約5cm,以及豬頸動脈5cm,將血管材料裁剪成0.5×0.5cm的血管片。用胰酶法對血管材料進行脫細胞處理,并且對脫細胞水平進行鑒定。將符合標準的血管材料凍干保存。用胰酶法制作豬頸動脈和大鼠降頸動脈脫細胞血管材料,并且對脫細胞水平進行鑒定。實驗組在6周齡SD大鼠皮下植入同種脫細胞血管材料(N=6);對照組6周齡SD大鼠皮下植入豬頸動脈脫細胞血管(N=6),每只四個位點。兩組內(nèi)取材時間分別為血管移植后2周和4周。通過HE染色、天狼星紅染色、免疫熒光染色、免疫組化以及Von Kossa硝酸銀法檢查材料于動物體內(nèi)移植后的再細胞化及鈣化情況是否有差異。結(jié)果:(1)脫細胞鏡下結(jié)果顯示,胰酶法脫細胞處理的血管材料沒有細胞核殘余,血管材料外觀形態(tài)基本正常。豬脫細胞血管DNA平均光密度值為(4.59±0.49),未經(jīng)脫細胞血管處理的豬血管DNA光密度值(564.35±26.13)。同種脫細胞血管DNA平均光密度值(5.45±0.24),處理前的同種血管DNA光密度值(497.1±7.12)。表明該處理方法可以有效去除血管組織中的細胞成分。(2)天狼猩紅染色顯示2h胰酶的處理的血管組織綠色彈性纖維缺失斷裂明顯,表明血管外膜、中膜彈性纖維有明顯損害。胰酶處理1h,Ⅰ、Ⅲ型彈力纖維波浪狀結(jié)構(gòu)保存相對完好。0.05%胰酶濃度37℃處理1h的血管材料能夠有效去除細胞成分,并且保留較好的血管彈性纖維形態(tài)。(3)兩周后從大鼠體內(nèi)取出血管,血管移植物基本保持原有形狀外觀,沒有分解的征象,外邊可見包裹的纖維組織。HE染色可見大量的自體細胞滲入脫細胞血管的纖維蛋白支架內(nèi)。每個時間點兩組血管細胞滲入數(shù)量均有明顯差異(二周P=0.023,四周P=0.019)。宿主細胞通過血管兩側(cè)的斷裂位置滲入的程度更深,數(shù)量更多。在遠離斷端的靠近血管壁中心的位置,細胞滲入主要發(fā)生在內(nèi)外膜(行進方向為血管橫截面方向),滲入速度較血管斷端慢。4周的皮下植入,可以見到包裹血管的纖維組織中有滋養(yǎng)血管生長,包裹血管材料周圍的纖維組織內(nèi)也布滿自體細胞,自體組織與移植血管組織沒有明顯界限,需要通過移植組織的彈性纖維條狀形態(tài)進行區(qū)分。(4)細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),同種脫細胞血管中引起的巨大多核巨噬細胞的數(shù)量少于異種脫細胞血管。二周時同種脫細胞血管鏡下的多核巨噬細胞滲入個數(shù)為 1.60± 1.70 個/7.6*104μm2,異種脫細胞血管為 2.14±1.64 個/7.6*104μm2,兩組沒有顯著性差異(P=0.055)。四周時,多核巨噬細胞滲入增多,同種材料中6.58±2.72個/7.6*104 μ m2,異種材料中7.85±3.15個/7.6*104 μ m2,兩組有顯著性差異(P=0.012)。鏡下可見,巨大多核的巨噬細胞多出現(xiàn)于血管材料表面,難以滲入血管材料內(nèi)部。CD68免疫組化染色的巨噬細胞明顯聚集于血管內(nèi)外膜接觸表面,提示血管與自體組織接觸表面發(fā)生著巨噬細胞介導的炎癥反應(yīng)。(5)鈣化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),4周時,兩組的鈣化鏡下未見明顯差異,原子火焰法檢測鈣化2周時同種脫細胞血管鈣化為1.08±0.34μg/mg,異種脫細胞血管鈣化為1.23±0.32μg/mg(P=0.44);4周時同種脫細胞血管鈣化為1.75±0.34μg/mg,異種脫細胞血管鈣化為3.06±0.30μg/mg(P0.01)。同種脫細胞血管的鈣化程度兩周、四周時均明顯輕于異種血管組。結(jié)論:通過0.05%胰酶、SDS、Triton的化學消化法可以制作脫細胞率達99%以上的細胞外基質(zhì)。同種或異種脫細胞血管支架,雖然去除了 99%以上的細胞成分,在動物體內(nèi)實驗仍然引起以巨噬細胞為主的炎癥細胞聚集。同種脫細胞血管支架在動物體內(nèi)引起多核巨噬細胞的數(shù)量明顯少于異種脫細胞血管支架。同種脫細胞血管支架在動物體內(nèi)4周引起的鈣化程度明顯小于異種脫細胞血管支架。脫細胞血管的鈣化反應(yīng)與巨噬細胞介導的免疫炎癥反應(yīng)明顯相關(guān),然而具體機制仍需要進一步探究。第二部分脂肪干細胞體外分化得到的脂肪細胞分泌功能的鑒定目的:種子細胞的應(yīng)用在血管組織工程里十分普遍,他們可以通過自身分泌的活性因子改變血管材料局部微環(huán)境,改善機體細胞對材料的細胞免疫反應(yīng),引導材料重塑。正常體內(nèi)血管周圍是存在密集結(jié)締組織和脂肪組織包裹的,血管周圍的脂肪細胞分泌功能影響著血管鈣化的病理生理過程。然而對于脂肪細胞的培養(yǎng),沒有標準流程,本研究擬從大鼠腹股溝脂肪組織中提取脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探索其分化為脂肪細胞的條件,并且檢測其分泌抗鈣化因子的能力。為將來在組織工程血管中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)支持。方法:通過Ⅰ型膠原酶消化法提取大鼠腹股溝脂肪干細胞,并在光鏡下進行形態(tài)學觀察,應(yīng)用流式細胞學對P3代進行表型檢驗。對P1、P2、P3、P4、P5代均進行成脂分化培養(yǎng),比較哪一代ADSCs分化為脂肪細胞的效率較高,油紅0染色,計數(shù)統(tǒng)計成脂分化率。取出P3代ADSCs細胞進行成脂分化培養(yǎng),免疫酶聯(lián)染色法檢測ADSCs和分化來的脂肪細胞分泌脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)的能力,設(shè)立標準品,做標準曲線,通過曲線計算樣品濃度。細胞計數(shù)由兩人不知道分組的情況下完成。結(jié)果中的數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標準差”形式表示,兩組間比較用T檢驗。多組間比較用ANOVA單因素方差分析,兩兩比較用LSD檢驗。使用SPSS.20.0進行統(tǒng)計分析,P0.05被認為有統(tǒng)計學差異。結(jié)果:提取細胞經(jīng)過24-48小時后開始貼壁,于5-7天開始形成集落或團簇生長,7天基本達到80%融合,細胞形態(tài)均一成長梭型外觀,細胞排列緊密形成典型旋渦狀結(jié)構(gòu)。傳代到P3代對細胞表型進行檢測:少于3.6%的細胞表達造血干細胞表面因子CD34;CD29,CD166間質(zhì)細胞表面標志,均有60%以上的表達;邊緣型造血干細胞表面抗體ABCG2表達約為42%,與以往文獻報道相符,可以確定提取成功ADSCs。對P3,P4,P5代進行成脂分化7天的平均成脂分化率分別為61.6± 15.4%、57.23±6.7%、55.8±12.96%,均高于55%,然而P1、P2成脂分化率分別為9.06±4.82%、35.6±12.1%,均低于35%(P0.05)組間具有顯著差異。雖然P3,P4,P5代兩兩無顯著性差異,但與鏡下可見P4、P5成脂分化出現(xiàn)較多細胞漂浮缺失部位,而P3代細胞貼壁情況良好。表明在第P3代的ADSCs誘導來的脂肪細胞成脂分化效率較好,成脂分化過后,漂浮死亡細胞較少。免疫酶聯(lián)方法檢測結(jié)果表明脂肪細胞可以大量分泌APN(67.86±2.36 ng/ml/天)、VEGF(757.91±21.83 pg/ml/天)HGF、(261.8±21.6pg/ml/天)。ADSCs 分泌的 APN(低于 1.56ng/ml/天)、VEGF(214.01±11.61 pg/ml/天)相對脂肪細胞分泌功能較低(P0.01)。結(jié)論:脂肪來源的干細胞可以成功分化為具有分泌大量抗炎癥因子APN和血管再生因子VEGF和HGF的脂肪細胞。脂肪干細胞的P3代在分化7天后達到成脂分化率較高。第三部分分化來的脂肪細胞的分泌功能影響異種脫細胞血管在動物體內(nèi)的炎癥及鈣化反應(yīng)目的:心外科血管移植材料到患者體內(nèi)后,經(jīng)歷著一系列新細胞的長入以及免疫炎癥因子的作用,其中巨噬細胞介導的炎癥反應(yīng)以及磷酸鹽沉積與移植血管的鈣化密切相關(guān)。故對于免疫炎癥的干預(yù)可能是減輕材料鈣化途徑。體內(nèi)外的研究均表明,脂聯(lián)素(Adiponectin,APN)具有抑制鈣化的作用。鑒于脂肪細胞可以分泌大量APN和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),還有肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)的能力。本實驗希望通過誘導脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分化為脂肪細胞(Induced Adipocyte Cells,IACs),并且用溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿建立脂肪細胞片(Induced Adipocyte Cell-Sheets,IAC-S),直接粘附于脫細胞血管材料型工程血管材料。檢測IAC-S在體內(nèi)的分泌功能,以及對脫細胞血管材料炎癥及鈣化的影響。方法:用我們以前的方法建立脫細胞豬頸動脈血管材料,并對脫細胞有效性進行檢測,裁剪成1.0×1.0厘米大小的血管片,凍干備用。對實驗組大鼠腹股溝脂肪干細胞的提取并且傳代培養(yǎng),并且將P3代細胞種植于溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿上,融合至80%時進行成脂肪細胞分化,建造脂肪細胞片。對脂肪細胞片的分泌APN、VEGF、HGF的分泌功能進行鑒定。應(yīng)用轉(zhuǎn)移膜將IAC-S完整轉(zhuǎn)移并且粘附在豬脫細胞血管材料外膜,制作成IAC-S處理的脫細胞血管材料。實驗組將IAC-S血管(N=6)移植于相應(yīng)的供體大鼠,對照組移植豬頸動脈脫細胞血管(N=6),1、2、4、8周時,依次取出每個位點移植物。分別做HE染色、免疫熒光染色、Von Kossa硝酸銀染色、以及原子火焰法檢測材料鈣含量檢測。連續(xù)變量符合正態(tài)分布時以均數(shù)±標準差表示;不符合正態(tài)分布用四分位數(shù)表示;采用獨立樣本T檢驗方式或非參數(shù)檢驗。比較兩組巨噬細胞(Macrophage)滲入數(shù)量以及分型(Macrophage 1,M1;Macrophage 2,M2),M1/M2比值,鈣化程度。P0.05表示差異有顯著性。統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件。結(jié)果:(1)成功通過胰酶法制做出來了脫細胞豬頸動脈材料。(2)大鼠腹股溝脂肪組織能夠成功分離、誘導培養(yǎng)出具有分泌功能的脂肪細胞。通過溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿,我們可以建造出完整的IAC-S。通過細胞轉(zhuǎn)移膜,可以把IAC-S轉(zhuǎn)移到脫細胞血管材料表面,構(gòu)成貼和IAC-S的脫細胞血管材料。(3)免疫酶聯(lián)染色法可以檢測到APN和VEGF分泌量在成脂分化過后明顯增高:APN由低于1.56ng/ml/細胞片/天升高到70.25±6.1 ng/細胞片/天(P0.01);VEGF 由 226.93±40.72 pg/細胞片/天升高到 805±25.92 pg/細胞片/天(P0.01)。然而 HGF 分泌量由 368.9±31.02 pg/細胞片/天降低到265.39 ± 10.74pg/細胞片/天(P0.01)。(4)免疫熒光染色表明IAC-S在移植一月后仍具有分泌APN的能力。(5)在第4和8周,單純脫細胞血管組中,CCR7+細胞(M1)明顯高于CD163+細胞(M2)的比例(P0.001),并且第8周時多核巨噬細胞明顯增多。然而,IAC-S處理組的血管材料中,M2型巨噬細胞相對于M1型則占有較大比例(P0.001)(5)脫細胞血管組的M1/M2均大于1,每個時間點的促炎型M1巨噬細胞均多于M2抗炎巨噬細胞;而IAC-S組M1/M2均小于1,每個時間點的抗炎型M2巨噬細胞均多于M1促炎巨噬細胞。(6)單純脫細胞血管組的鈣化程度明顯升高,兩組在2、4、8周的取材均有統(tǒng)計學差異性(P0.05)。結(jié)論:溫度反應(yīng)性培養(yǎng)皿可以成功建立具有分泌功能的脂肪細胞片,該脂肪細胞片在體內(nèi)外均能分泌APN、VEGF、HGF因子。脂肪細胞片覆蓋的脫細胞血管支架在動物體內(nèi)能夠引起滲入的巨噬細胞表型的改變,使得M2抗炎型巨噬細胞比例增高,并且鈣化程度明顯降低。
【學位單位】:北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】:博士
【學位年份】:2018
【中圖分類】:R318.08;R654
【部分圖文】:

動脈,胰酶,彈性纖維


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動脈,胰酶,彈性纖維,統(tǒng)計分析


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標準曲線,胰酶,動脈,血管


圖3胰酶處理1小時豬頸動脈天狼星紅染色圖4胰酶處理2小時豬頸動脈天狼猩紅染色逡逑(I型彈性纖維呈橘紅色,III型彈性纖維綠色。圖三,圖四)。逡逑2.脫細胞處理后組織血管DNA檢測結(jié)果逡逑通過測量DNA標準品的吸光度,計算所得回歸方程為Y=0.8746X+3.07(r=0.9985),線性范圍為1-500ng/ml。計算得到提取的豬脫細胞血管DNA平均密度值為(4.邋59±0.邋49),未經(jīng)脫細胞血管處理的豬血管DNA光密度值(564.邋3526.邋13)。同種脫細胞血管DNA平均光密度值(5.45±0.24),處理前的同種血管DN光密度值(497.邋1±7.邋12)。相應(yīng)DNA濃度見圖,結(jié)果說明,脫細胞處理有效徹底,逡逑基本去除血管原有DNA物質(zhì)。逡逑TNE緩沖液溶解ADNA標準曲線邐處理對后兩組DNA濃交較逡逑600邋600邋邐邐逡逑496.邋65逡逑500邋M3T.S3邐逡逑i邋400邋 ̄m ̄\邐邐逡逑300邐*邐Rf|邐0豬血苷組逡逑2邐^邋300邋一邋H邋邐邋0邋同種fl?組逡逑、邐I-,邐逡逑100邋—邐

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本文編號:2821435


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