目的:研究骨碎補(bǔ)總黃酮(osteopractic total flavone,OTF)聯(lián)合納米骨材料(nHAC)對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖、分化及血管新生的影響。方法:本研究分為四個(gè)部分。第一部分:著重探討OTF聯(lián)合nHAC材料對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和凋亡的影響,通過(guò)MC3T3-E1成骨細(xì)胞與nHAC材料共培養(yǎng),以骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù),CKK8法測(cè)定成骨細(xì)胞活性,組織病理染色觀察成骨細(xì)胞的病理改變,掃描電鏡觀察成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率,觀察不同濃度OTF聯(lián)合nHAC材料對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及凋亡的影響。第二部分:著重探討OTF聯(lián)合nHAC材料誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制,通過(guò)PNPP法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)活性,ELISA測(cè)定骨鈣蛋白(OCN),茜素紅染色鑒定,PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá),觀察成骨鈣化作用機(jī)制。第三部分:著重探討OTF聯(lián)合nHAC材料調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的效應(yīng)機(jī)制。本部分研究將MC3T3-E1細(xì)胞與nHAC材料共培養(yǎng),以O(shè)TF為藥物干預(yù),以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β及Wnt通路抑制劑Dickkopf-1干預(yù)為正負(fù)對(duì)照,免疫熒光標(biāo)記,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin通路中Wnt與LRP結(jié)合情況,通過(guò)real-time PCR 和 western-blot 技術(shù)檢測(cè)調(diào)控 β-catenin,LRP 5,Gsk-3β,Cyclin D1,Runx-2等基因和蛋白表達(dá)的改變。第四部分:著重探討OTF聯(lián)合nHAC材料對(duì)hFOB-人血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)共培養(yǎng)體系中HUVEC生物學(xué)功能的影響。建立hFOB-HUVECHE共培養(yǎng)復(fù)合nHAC材料,不同濃度OTF干預(yù)實(shí)驗(yàn)組,染色觀察HUVEC形態(tài)學(xué)觀察,CKK8檢測(cè)HUVEC增殖,Transwell細(xì)胞劃痕觀察HUVEC遷移,ELISA法檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 2(Fibroblast growth factor-2,FGF-2)含量。結(jié)果:第一部分:在CKK-8細(xì)胞活性測(cè)定中,100μg/mL和250μg/mL OTF濃度組明顯促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖,而兩種濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響無(wú)顯著差異。倒置顯微鏡下對(duì)各組培養(yǎng)細(xì)胞觀察結(jié)果顯示,DKK1模型組其成骨細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制,細(xì)胞貼壁數(shù)量較其他組明顯減少,DKK 1+TGF-β、DKK l+OTF250μg/mL、DKK 1+nHAC+TGF-β、DKK1+nHAC+OTF250μg/mL組要優(yōu)于正常組、模型組及其他實(shí)驗(yàn)組,48h時(shí)基本覆蓋底部,鏡下觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好,細(xì)胞形態(tài)成梭形或多角形,核較大呈圓形或橢圓形。SEM培養(yǎng)24小時(shí)觀察,DKK1模型組成細(xì)胞數(shù)量較其他組明顯減少,三組材料組中的大量細(xì)胞組已經(jīng)粘附在并且已經(jīng)擴(kuò)增和增殖,見材料的表面和孔隙內(nèi)均有細(xì)胞附著,細(xì)胞已伸展成梭形或多角形,伸出偽足豁附材料上,其中DKK 1+OTF250μg/mL、DKK 1+nHAC+OTF250μg/mL 組較 DKK 1+nHAC+OTF100μg/mL 組細(xì)胞生長(zhǎng)更好。非材料組DKK 1+TGF-β、DKK 1+OTF250μg/mL組細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量和表面絲狀細(xì)胞外基質(zhì)增多,細(xì)胞表面可見大量的微絨毛,部分孔內(nèi)細(xì)胞和分泌的基質(zhì)融合成片,表示細(xì)胞狀態(tài)良好。48h時(shí),細(xì)胞數(shù)量增多,可見細(xì)胞體表面有顆粒狀鈣鹽結(jié)晶沉積,一些細(xì)胞被更多礦物質(zhì)沉積覆蓋。AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。從24h到48h,隨著OTF濃度的增加,MC3T3-E1細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)基本平穩(wěn)趨勢(shì)。DKK 1+TGF-β、DKK1+OTF250μg/mL、DKK1+nHAC+TGF-β、DKK1+nHAC+OTF250μg/mL 組凋亡率顯著低于模型組和正常組,DKK1+OTF100μg/mL、DKK 1+nHAC+OTF100μg/mL 組凋亡率顯著低于模型組,實(shí)驗(yàn)組組間凋亡率未見顯著性差異。第二部分:OTF能夠誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)入成骨細(xì)胞,提高ALP活性和OCN濃度,同時(shí)升高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)物中Col-I,OPN和OCN mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)水平。100μg/mL和250μg/mL濃度組OTF的成骨能力沒(méi)有顯著差異,但顯著高于其它組的成骨能力。第三部分:在24小時(shí)、48小時(shí)之后分別檢測(cè)β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX2及CyclinD1基因及蛋白水平表達(dá)的變化。24小時(shí)和48小時(shí)后DKK1+TGF-β、DKK 1+OTF 100μg/mL、DKK 1+OTF250μg/mL 三組的 β-catenin、LRP5、Runx2 及 CyclinD1基因及蛋白表達(dá)較正常組、模型組明顯增加,GSK3β基因及蛋白表達(dá)明顯降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異;DKK1+TGF-β、DKK1+OTF250μg/mL 二組的 β-catenin、LRP5、Runx2及CyclinD1基因及蛋白的表達(dá)水平明顯高于DKK 1+OTF 100μg/mL組。第四部分:CKK8結(jié)果顯示成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用可能性較大,OTF對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖促進(jìn)作用無(wú)統(tǒng)計(jì)差異,nHAC材料對(duì)兩種細(xì)胞的貼附、生長(zhǎng)和增殖均無(wú)影響,表明該材料具有良好的生物相容性。ELISA結(jié)果表明成骨細(xì)胞能夠分泌FGF-2,且結(jié)合CCK8的結(jié)果來(lái)看,FGF-2含量與HUVEC細(xì)胞的增殖能力呈現(xiàn)大致相同的趨勢(shì),對(duì)VEGF分泌物無(wú)明顯作用。結(jié)論:(1)通過(guò)OTF聯(lián)合nHAC材料對(duì)鼠成骨細(xì)胞的不同組別體外復(fù)合培養(yǎng)的初步研究,細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果較一致,相互驗(yàn)證,表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的良好功能狀態(tài),觀察到OTF 100pg/mL和250μg/mL濃度組提高成骨細(xì)胞黏附、增殖活力最佳并保持其正常細(xì)胞形態(tài),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),生長(zhǎng)趨勢(shì)越好,具有明顯地劑量依賴和時(shí)間依賴。(2)nHAC材料具備很好的生物相容性,對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性,而且中藥OTF復(fù)合nHAC材料能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,抑制凋亡,保持正常的細(xì)胞形態(tài),但其成骨效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。(3)OTF能夠誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化,提高ALP活性和OCN濃度,同時(shí)升高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)物中Col-I,OPN和OCNmRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)水平。濃度為100μg/mL和250μg/mL的OTF可以有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的分化、礦化。(4)通過(guò)體外培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞與nHAC復(fù)合體,OTF誘導(dǎo)培養(yǎng)后具有成骨細(xì)胞的活性及生物學(xué)特性,適宜作為構(gòu)建組織工程骨的種子細(xì)胞和三維條件下進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。(5)OTF能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化增殖,促進(jìn)骨形成及骨礦化,并且可增加β-catenin、LRP5、RUNX2的表達(dá),下調(diào)GSK3β的表達(dá),可以推測(cè)OTF通過(guò)激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)作用,這是可能作用機(jī)制之一。(6)nHAC材料具有良好的細(xì)胞結(jié)合能力,hFOB-HUVEC在支架材料上共培養(yǎng),可以良好的進(jìn)行貼附、生長(zhǎng)和增殖。(7)HUVEC的增殖可能與成骨細(xì)胞分泌FGF-2有關(guān),而OTF對(duì)成骨細(xì)胞分泌FGF-2沒(méi)有促進(jìn)作用。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

圖１－１納米晶磷酸鈣／膠原基骨材料（ｎＨＡＣ）電鏡觀察逡逑１．２．２實(shí)驗(yàn)藥物逡逑（１）骨碎補(bǔ)總黃酮（ｏｓｔｅｏｐｒａｃｔｉｃ邋ｔｏｔａｌ邋ｆｌａｖｏｎｅ，ＯＴＦ）逡逑ＯＴＦ購(gòu)自于北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Ｚ２００３０００７，生產(chǎn)批號(hào)：０４０８００８１，逡逑含量＞８０％），質(zhì)譜（ＭＳ）邋（Ｅｓｑｕｉｒｅ邋６０００，邋Ｂｒｕｋｅｒ，德國(guó)）鑒定本次實(shí)驗(yàn)用藥，鑒定條件逡逑如下：離子源為ＥＳＩ，霧化壓力為３５ｐｓｉ，干燥氣體流量為ｌｌｍｌ／ｍｉｎ，干燥溫度為３５０°Ｃ，逡逑質(zhì)量范圍質(zhì)譜分析為ｌ00－ｌ000ａｍＵ，離子模式為陰性（見圖卜２）。ＯＴＦ溶液的配制：（１）逡逑用含３％ＦＢＳ的ｃｔ－ＭＥＭ培養(yǎng)基將ＯＴＦ配成５００ｍｇ／ｍｌ溶液，４°Ｃ保存；（２）用含３％ＥＢＳ逡逑的邋ｏｔ－ＭＥＭ邋培養(yǎng)基將邋ＯＴＦ邋溶液濃度稀釋成邋１０００ｐｇ／ｍＬ、５００｜ａｇ／ｍＬ、２５０｜ｉｇ／ｍＬ、１００｜＿ｉｇ／ｍＬ、逡逑５０｜ｉｇ／ｍＬ、Ｏｐｇ／ｍＬ，現(xiàn)用現(xiàn)配。逡逑（２）邐ＤＫＫ１邋（５７２４８－Ｍ０８Ｈ）：邋Ｓｉｎｏ邋Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋公司（美國(guó)）逡逑藥物濃度配制：①在ＤＫＫ－１中加入３％ＦＢＳ的ｃｔ－ＭＥＭ培養(yǎng)基７０叫，使ＤＫＫ１溶逡逑0．１５ｍ／ｍｌ；ＤＫＫ１４°Ｃ，１２０００ｒｍ心３０ｓ；入３％逡逑

１．３小鼠ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞獲取及與ｎＨＡＣ材料共培養(yǎng)逡逑１．３．１邐ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１邋細(xì)胞培養(yǎng)逡逑用含１０％ＦＢＳ的ａ－ＭＥＭ培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞前體細(xì)胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１并置于逡逑３７°Ｃ，邋５％Ｃ０２恒溫培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞覆蓋率達(dá)到８０％－９０％時(shí)傳代。逡逑１．３．２邐ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１邋細(xì)胞傳代逡逑（１）將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出至超凈臺(tái)，并將原有培養(yǎng)基吸盡；逡逑（２）用過(guò)濾除菌的ＰＢＳ將細(xì)胞清洗３遍，０．２５％邋ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ，３７°Ｃ，消化３０ｓ；逡逑（３）在細(xì)胞變圓后加入完全培養(yǎng)基終止其消化；逡逑（４）細(xì)胞在移液器吹打至均勻懸浮后移至１５ｍｌ離心管中，ｌＯＯＯｒｍｐ離心５ｍｉｎ；逡逑（５）棄去上清，加入２ｍｌ培養(yǎng)基后，重懸；逡逑（６）將細(xì)胞在重懸后以１：３接種到新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置３７°Ｃ，邋５％Ｃ０２飽和濕度培養(yǎng)逡逑箱。逡逑１．３．３邐ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１邋細(xì)胞凍存逡逑

邐骨碎補(bǔ)總黃酮聯(lián)合材料對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化及血管新生的影響邐逡逑１．９統(tǒng)計(jì)方法逡逑本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析運(yùn)用ＳＰＳＳ邋２０軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，逡逑對(duì)數(shù)據(jù)先做正態(tài)和方差齊檢驗(yàn)，符合者用單因素方差分析比較，組間比較用ＬＳＤ分析逡逑法。若不符合正態(tài)分布或方差不齊者，用非參數(shù)檢驗(yàn)。戶＜0．0５為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。逡逑２結(jié)果逡逑２．１不同濃度骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞活性的影響逡逑如圖１－３所示ＣＫＫ－８檢測(cè)結(jié)果：隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，０｜ｉｇ／ｍＬ、５０｜ａｇ／ｉｎＬ、１００（ａｇ／ｍＬ、逡逑２５０ｐｇ／ｍＬ濃度組ＯＴＦ刺激后ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞的數(shù)量遞增，５００｜＿ｉｇ／ｍＬ、１０００｜ａｇ／ｍＬ濃度逡逑組ＯＴＦ刺激后ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞數(shù)量遞減。在２４ｈ和４８ｈ后ｌＯＯ＾ｇ／ｍＬ和２５0ｎｇ／ｍＬ邋ＯＴＦ逡逑濃度組細(xì)胞活性均顯著高于其它組ＣＰ＜0．0５），邋１０0ｎｇ／ｍＬ和２５０｜＿ｉｇ／ｍＬ兩組之間沒(méi)有顯著逡逑性差異（辦0．0５）。空白組比較＊尸＜０．０５＊＊戶＜０．０１。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820871