發(fā)布時間：2020-09-17 10:54

　　 研究背景:骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤之一,在人體常好發(fā)于脛骨近端和股骨遠(yuǎn)端等長管狀骨的干骺端,死亡率極高,隨著新輔助化療和手術(shù)在臨床治療中廣泛應(yīng)用,骨肉瘤5年生存率可達(dá)到50%-60%;然而,骨肉瘤早期癥狀隱匿,極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,約40%的骨肉瘤患者在確診時存在肺部的微小轉(zhuǎn)移,并提示預(yù)后不良,嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種內(nèi)源性小非編碼RNA,其長度位于20-24個核苷酸之間,miRNA主要與目標(biāo)信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)結(jié)合以沉默目標(biāo)基因表達(dá)。miRNA已被證實(shí)為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,在多種生理或病理過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)研究,許多miRNA與細(xì)胞增殖,侵襲,凋亡及細(xì)胞周期有密切的關(guān)系。最近幾項(xiàng)研究報道,microRNA-106a在人類幾種不同類型的腫瘤中表達(dá)上調(diào),參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,檢測microRNA-106a在骨肉瘤中的表達(dá)水平并探討其可能的靶點(diǎn)對于進(jìn)一步探索骨肉瘤新的治療具有重要意義。目的:檢測microRNA-106a在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平,預(yù)測其與骨肉瘤增殖和侵襲有關(guān)的重要靶點(diǎn),并通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其靶點(diǎn),探索可能的調(diào)控機(jī)制,為骨肉瘤的靶向治療提供新的方向。研究方法:提取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的骨肉瘤細(xì)胞U2OS及正常成骨細(xì)胞hFOB1.19的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用實(shí)時定量PCR(RT-qPCR)檢測兩者miR-106a的相對表達(dá)情況。運(yùn)用介導(dǎo)含miR-106a抑制序列小干擾RNA或含miR-NC的無義序列小干擾RNA的慢病毒轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞,沉默miR-106a的表達(dá),構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組(miR-106a-inhibitor)和對照組(miR-NC),把含miR-106a抑制序列的U2OS細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,把含miR-NC無義序列的U2OS細(xì)胞作為對照組,利用MTS增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖,利用Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移及侵襲能力,利用流式細(xì)胞儀分析法檢測細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)后,獲取開放miRNA數(shù)據(jù)庫(TargetScan,PicTarget和MicroCosm)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測miR-106a靶基因。隨后運(yùn)用Western Blot和雙熒光素酶報告基因來驗(yàn)證所預(yù)測的靶基因。結(jié)果:根據(jù)實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示,miR-106a的表達(dá)在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS中相對正常成骨細(xì)胞hFOB1.19中顯著上調(diào)(P0.01)。敲減掉miR-106a的表達(dá)后,對U2OS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力有抑制作用,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期存在S期下調(diào),G2/M期阻滯;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率上升。免疫印跡分析表明轉(zhuǎn)染了miR-106a抑制序列的U2OS細(xì)胞中VNN2在蛋白水平表達(dá)高于陰性對照(miR-NC)組;實(shí)時定量PCR結(jié)果也表明轉(zhuǎn)染了miR-106a抑制序列的U2OS細(xì)胞中VNN2在基因水平表達(dá)高于陰性對照(miR-NC)組。含有VNN2信使RNA3'非翻譯區(qū)序列的螢光素酶報告驗(yàn)證VNN2即是miR-106a的結(jié)合靶點(diǎn)之一,這也進(jìn)一步證實(shí)了生物信息學(xué)的預(yù)測。結(jié)論:敲除骨肉瘤中miR-106a的表達(dá),可以提高VNN2的表達(dá)水平,誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞周期失調(diào)、增加細(xì)胞凋亡率,從而來抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R738.1
【部分圖文】：

22圖 2 慢病毒感染效率確認(rèn)及驗(yàn)證A:代表慢病毒感染U2OS細(xì)胞72小時后，對照組和實(shí)驗(yàn)組在同一視野下的白光圖和熒光圖。細(xì)胞發(fā)出綠色熒光代表慢病毒感染成功，miR-106a-inhibitor成功介導(dǎo)入U2OS細(xì)胞內(nèi)。所有細(xì)胞使用熒光倒置顯微鏡并在×400倍視野下觀察拍照，B：統(tǒng)計圖。慢病毒感染U2OS細(xì)胞72小時

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文胞體外遷移和侵襲能力進(jìn)行測試。使用倒置顯微鏡，對穿過 Transwell 上室，緊貼上室膜底側(cè)的細(xì)胞進(jìn)行拍照并計數(shù)。如圖 4A 所示，轉(zhuǎn)染 miR-106a-inhibitor 的 U2OS細(xì)胞相比轉(zhuǎn)染 miR-NC 的細(xì)胞，穿過 Transwell 上室的細(xì)胞數(shù)明顯減少；重復(fù)Transwell 實(shí)驗(yàn)三次，選取三次實(shí)驗(yàn)后鏡下視野所見細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計得，沉默 U2OS細(xì)胞 miR-106a 的表達(dá)，穿過 Transwell 上室的細(xì)胞數(shù)明顯減少（p < 0.05），U2OS細(xì)胞體外遷移和侵襲能力顯著降低（圖 4B）。

26圖 5 miR-106a-inhibitor 和 NC 細(xì)胞周期分布A:代表介導(dǎo) miR-106a-inhibitor 和 NC 的慢病毒感染 U2OS 細(xì)胞 72 小時后，對照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期分布圖，B:統(tǒng)計圖。對細(xì)胞各周期細(xì)胞數(shù)占全部細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行統(tǒng)計分析。 *,實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，P < 0.05。4.6 沉默 U2OS 細(xì)胞中 miR-106a 的表達(dá)能增加 U2OS 細(xì)胞的凋亡率。為了探討慢病毒感染介導(dǎo) miR-106a-inhibitor 后，細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力被抑制的機(jī)制，采用流式細(xì)胞儀分析實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，沉默 miR-106a 的表達(dá)，可以增加 U2OS 細(xì)胞的凋亡率（圖 6A）；進(jìn)一步統(tǒng)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Xinyu Tan;Shicai Fan;Wen Wu;Yin Zhang;;MicroRNA-26a inhibits osteosarcoma cell proliferation by targeting IGF-1[J];Bone Research;2015年04期

本文編號：2820632