研究背景:骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤之一,在人體常好發(fā)于脛骨近端和股骨遠端等長管狀骨的干骺端,死亡率極高,隨著新輔助化療和手術在臨床治療中廣泛應用,骨肉瘤5年生存率可達到50%-60%;然而,骨肉瘤早期癥狀隱匿,極易發(fā)生遠處轉移,約40%的骨肉瘤患者在確診時存在肺部的微小轉移,并提示預后不良,嚴重威脅著人類的生命和健康。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種內源性小非編碼RNA,其長度位于20-24個核苷酸之間,miRNA主要與目標信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)結合以沉默目標基因表達。miRNA已被證實為轉錄后調節(jié)因子,在多種生理或病理過程中發(fā)揮重要作用。據研究,許多miRNA與細胞增殖,侵襲,凋亡及細胞周期有密切的關系。最近幾項研究報道,microRNA-106a在人類幾種不同類型的腫瘤中表達上調,參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,侵襲和轉移。因此,檢測microRNA-106a在骨肉瘤中的表達水平并探討其可能的靶點對于進一步探索骨肉瘤新的治療具有重要意義。目的:檢測microRNA-106a在骨肉瘤細胞中的表達水平,預測其與骨肉瘤增殖和侵襲有關的重要靶點,并通過實驗來驗證其靶點,探索可能的調控機制,為骨肉瘤的靶向治療提供新的方向。研究方法:提取狀態(tài)良好、處于對數生長期的骨肉瘤細胞U2OS及正常成骨細胞hFOB1.19的總RNA并逆轉錄成cDNA,采用實時定量PCR(RT-qPCR)檢測兩者miR-106a的相對表達情況。運用介導含miR-106a抑制序列小干擾RNA或含miR-NC的無義序列小干擾RNA的慢病毒轉染U2OS細胞,沉默miR-106a的表達,構建實驗組(miR-106a-inhibitor)和對照組(miR-NC),把含miR-106a抑制序列的U2OS細胞作為實驗組,把含miR-NC無義序列的U2OS細胞作為對照組,利用MTS增殖實驗檢測細胞的增殖,利用Transwell小室檢測細胞的遷移及侵襲能力,利用流式細胞儀分析法檢測細胞周期以及細胞凋亡率。細胞功能實驗后,獲取開放miRNA數據庫(TargetScan,PicTarget和MicroCosm)進行生物信息學預測miR-106a靶基因。隨后運用Western Blot和雙熒光素酶報告基因來驗證所預測的靶基因。結果:根據實時定量PCR結果顯示,miR-106a的表達在骨肉瘤細胞系U2OS中相對正常成骨細胞hFOB1.19中顯著上調(P0.01)。敲減掉miR-106a的表達后,對U2OS細胞的增殖、遷移和侵襲能力有抑制作用,流式細胞術檢測細胞周期存在S期下調,G2/M期阻滯;流式細胞術檢測細胞凋亡率上升。免疫印跡分析表明轉染了miR-106a抑制序列的U2OS細胞中VNN2在蛋白水平表達高于陰性對照(miR-NC)組;實時定量PCR結果也表明轉染了miR-106a抑制序列的U2OS細胞中VNN2在基因水平表達高于陰性對照(miR-NC)組。含有VNN2信使RNA3'非翻譯區(qū)序列的螢光素酶報告驗證VNN2即是miR-106a的結合靶點之一,這也進一步證實了生物信息學的預測。結論:敲除骨肉瘤中miR-106a的表達,可以提高VNN2的表達水平,誘導骨肉瘤細胞周期失調、增加細胞凋亡率,從而來抑制骨肉瘤細胞的增殖,遷移和侵襲。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R738.1
【部分圖文】：

22圖 2 慢病毒感染效率確認及驗證A:代表慢病毒感染U2OS細胞72小時后，對照組和實驗組在同一視野下的白光圖和熒光圖。細胞發(fā)出綠色熒光代表慢病毒感染成功，miR-106a-inhibitor成功介導入U2OS細胞內。所有細胞使用熒光倒置顯微鏡并在×400倍視野下觀察拍照，B：統計圖。慢病毒感染U2OS細胞72小時

中國醫(yī)科大學碩士學位論文胞體外遷移和侵襲能力進行測試。使用倒置顯微鏡，對穿過 Transwell 上室，緊貼上室膜底側的細胞進行拍照并計數。如圖 4A 所示，轉染 miR-106a-inhibitor 的 U2OS細胞相比轉染 miR-NC 的細胞，穿過 Transwell 上室的細胞數明顯減少；重復Transwell 實驗三次，選取三次實驗后鏡下視野所見細胞進行計數統計得，沉默 U2OS細胞 miR-106a 的表達，穿過 Transwell 上室的細胞數明顯減少（p < 0.05），U2OS細胞體外遷移和侵襲能力顯著降低（圖 4B）。

26圖 5 miR-106a-inhibitor 和 NC 細胞周期分布A:代表介導 miR-106a-inhibitor 和 NC 的慢病毒感染 U2OS 細胞 72 小時后，對照組和實驗組的細胞周期分布圖，B:統計圖。對細胞各周期細胞數占全部細胞數的百分比進行統計分析。 *,實驗組與對照組相比，P < 0.05。4.6 沉默 U2OS 細胞中 miR-106a 的表達能增加 U2OS 細胞的凋亡率。為了探討慢病毒感染介導 miR-106a-inhibitor 后，細胞增殖、遷移及侵襲能力被抑制的機制，采用流式細胞儀分析實驗組和對照組細胞凋亡率。細胞凋亡分析結果顯示，沉默 miR-106a 的表達，可以增加 U2OS 細胞的凋亡率（圖 6A）；進一步統

【參考文獻】

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1 Xinyu Tan;Shicai Fan;Wen Wu;Yin Zhang;;MicroRNA-26a inhibits osteosarcoma cell proliferation by targeting IGF-1[J];Bone Research;2015年04期

本文編號：2820632