椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)被認(rèn)為是骨科最常見的疾病之一,也是導(dǎo)致頸部或腰背部疼痛的主要原因,已成為主要的公共衛(wèi)生問題,在世界范圍內(nèi)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成重大影響。IDD的病因是復(fù)雜和多因素的,包括基因遺傳、年齡、營(yíng)養(yǎng)代謝、生物力學(xué)等。盡管引發(fā)該疾病的機(jī)制乃存在爭(zhēng)議,但普遍認(rèn)為IDD是由于椎間盤細(xì)胞合成代謝和分解代謝之間不平衡導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)減少所致。目前臨床治療方法包括保守治療和手術(shù)治療,僅能減輕癥狀,無法阻止IDD的發(fā)生和發(fā)展,目前缺乏理想的治療方法能夠逆轉(zhuǎn)IDD病變。近來生物治療IDD的技術(shù)逐漸得到發(fā)展,包括細(xì)胞治療、組織工程、生長(zhǎng)因子和/或生物活性化合物。無機(jī)多聚磷酸鹽(inorganic polyphosphate,PolyP)作為一種生物活性化合物廣泛存在自然界和所以生物體中,它是由幾個(gè)至數(shù)百個(gè)無機(jī)磷酸鹽單體通過高能磷酸鍵聚合而成的線性多聚體。研究認(rèn)為PolyP的共價(jià)鍵中儲(chǔ)存高能量,其釋放出來的能量可參與氨基酸、核苷酸、糖和脂類這些主要分子的構(gòu)建。在體外實(shí)驗(yàn)中已報(bào)道PolyP能夠增加軟骨細(xì)胞及軟骨組織基質(zhì)的合成。此外,研究發(fā)現(xiàn)在牛的椎間盤組織中檢測(cè)到PolyP,0.5-1.0mM濃度的PolyP可以通過上調(diào)髓核細(xì)胞基質(zhì)基因的表達(dá)從而提高髓核組織合成代謝。目前PolyP對(duì)人的椎間盤細(xì)胞基質(zhì)和能量代謝的影響尚未見研究報(bào)道。因此,我們假設(shè)PolyP作為一種能量來源,能增加人椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的合成從而有利于干預(yù)和逆轉(zhuǎn)IDD。第1部分無機(jī)多聚磷酸鹽對(duì)椎間盤細(xì)胞增殖和基質(zhì)代謝的影響目的:研究PolyP對(duì)人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞增殖和基質(zhì)代謝的影響。方法:體外分離培養(yǎng)人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞,用三種不同濃度0,0.5mM和1.OmM PolyP-22(22磷酸鹽單位長(zhǎng)度的PolyP)處理人的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞,在倒置的顯微鏡下觀察PolyP處理后的纖維環(huán)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,并采用CyQUANT細(xì)胞增殖試劑法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性變化。利用不同濃度 PolyP 處理纖維環(huán)細(xì)胞 48 小時(shí)后,用 1,9-DimethylmethyleneBlue(DMMB)方法測(cè)定細(xì)胞糖胺聚糖含量、采用同位素35S-硫酸鹽標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞蛋白聚糖的合成量,采用同位素3H-脯氨酸標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞膠原蛋白和總蛋白的合成量。結(jié)果:PolyP能夠提高人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的增殖活性;采用DMMB方法測(cè)定和同位素標(biāo)記法檢測(cè)的結(jié)果也表明PolyP能夠增加細(xì)胞糖胺聚糖,蛋白聚糖,膠原蛋白和總蛋白的合成量。結(jié)論:PolyP能夠促進(jìn)纖維環(huán)細(xì)胞增殖,并能提高細(xì)胞基質(zhì)的合成量。第2部分無機(jī)多聚磷酸鹽對(duì)椎間盤細(xì)胞基質(zhì)代謝的作用機(jī)制目的:探討PolyP對(duì)椎間盤內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)合成和分解代謝動(dòng)態(tài)平衡的影響;以及探討PolyP對(duì)椎間盤細(xì)胞ATP生成量的影響。方法:用三種不同濃度0,0.5mM和1.OmM的PolyP-22處理人的椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞48小時(shí)后;用qRT-PCR檢測(cè)合成代謝的活性介質(zhì)聚集蛋白聚糖(aggrecan)和I型膠原(collagenI)的mRNA的表達(dá),以及檢測(cè)分解代謝的活性介質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloprotease-1,MMP-1)、MMP-3、血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-4)和 ADAMTS-5 的 mRNA 的表達(dá);采用蛋白免疫印跡(Western Blot)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)法在蛋白水平檢測(cè)合成代謝的標(biāo)志物aggrecan和collagen I的表達(dá),并采用Western Blot檢測(cè)分解代謝標(biāo)志物aggrecan-fragment的蛋白表達(dá);最后,利用ATPlite熒光免疫法測(cè)定三種不同濃度PolyP處理椎間盤細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)的ATP生成量的變化。結(jié)果:qRT-PCR結(jié)果分析說明PolyP處理的人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中,細(xì)胞代謝合成的aggrecan和collagen I的mRNA表達(dá)得到上調(diào),但是在代表分解代謝的基因表達(dá)中,PolyP上調(diào)MMP-3和ADAMTS-4的mRNA表達(dá)而降低MMP-1和ADAMTS-5的mRNA表達(dá)。免疫熒光和Western Blot的結(jié)果同樣證明PolyP能夠增加椎間盤治療纖維環(huán)細(xì)胞中aggrecan和collagen I的蛋白表達(dá)。但是Western Blot的結(jié)果表明分解代謝aggrecan-fragment的蛋白表達(dá)升高。同時(shí)PolyP能夠增加人椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的ATP的生成量。結(jié)論:在椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞中,增加PolyP含量可以上調(diào)細(xì)胞基質(zhì)合成基因的表達(dá)和ATP生成量,促進(jìn)纖維環(huán)細(xì)胞的合成代謝,但要確定PolyP如何在椎間盤細(xì)胞中調(diào)節(jié)分解基質(zhì)代謝和整體代謝平衡還需要更多的驗(yàn)證性研究。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R681.5
【部分圖文】：

貼壁較對(duì)照組快；所有組細(xì)胞形態(tài)均正常，未見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核固縮。與逡逑對(duì)照組比較，０．５ｍＭ和ｌ．ＯｍＭ邋ＰｏｌｙＰ兩組椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞生長(zhǎng)較快，胞質(zhì)豐富，逡逑偽足伸出明顯，但兩處理組之間未見明顯區(qū)別（圖１）。逡逑３ｈｏｕｒｓ逡逑２４ｈｏｕｒｓ逡逑＞邋？邋？逡逑４８ｈｏｕｒｓ逡逑ｍ’邐：邐ｊ邋ｍ逡逑ＯｍＭ邋ＰｏｌｙＰ邐０．５ｍＭ邋ＰｏｌｙＰ邐ＩｍＭ邋ＰｏｌｙＰ逡逑圖１．用不同濃度ＰｏｌｙＰ處理纖維環(huán)細(xì)胞后，倒置相差顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)三組纖逡逑維環(huán)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況。逡逑Ｆｉｇｌ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｗｉｔｈ邋ＰｏｌｙＰ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｗｅｒｅ逡逑ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕｎｄｅｒ邋ａ邋ｐｈａｓｅ邋ｃｏｎｔｒａｓｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ．逡逑１．４．２無機(jī)多聚磷酸鹽對(duì)人纖維環(huán)細(xì)胞增殖活性的影響逡逑為了評(píng)估ＰｏｌｙＰ對(duì)人纖維環(huán)細(xì)胞增值的影響，并確定ＰｏｌｙＰ濃度與細(xì)胞增殖逡逑的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度ＰｏｌｙＰ處理人纖維環(huán)細(xì)胞，培養(yǎng)１至７２小時(shí)。逡逑本實(shí)驗(yàn)所用的ＣｙＱＵＡＮＴ細(xì)胞增殖試劑盒是一個(gè)敏感性高、可重復(fù)并且簡(jiǎn)便的逡逑熒光微孔板檢測(cè)的方法。其靈敏度較比色法分析更靈敏，且無放射性。細(xì)胞內(nèi)逡逑１５逡逑

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ＰｏｌｙＰ處理組中的人纖維環(huán)細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞逡逑數(shù)目有升高（Ｐ＜0．0５）。而且在不同時(shí)間點(diǎn)，ｌ．ＯｍＭＰｏｌｙＰ相比０．５ｍＭＰｏｌｙＰ組逡逑中細(xì)胞數(shù)要增多，但兩組間并沒有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＞0．0５）（圖２）。逡逑ＯｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１０逡逑Ｈ？－０．５ｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑，９邐１ｍＭ邋Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｇｒｏｕｐ逡逑專８逡逑８逡逑Ｏ邋７逡逑Ｉ６逡逑１邋ｈｏｕｒ邋３邋ｈｏｕｒｓ邋６邋ｈｏｕｒｓ邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋２４邋ｈｏｕｒｓ邋４８邋ｈｏｕｒｓ邋７２邋ｈｏｕｒｓ逡逑圖２．采用ＣｙＱＵＡＮＴ細(xì)胞X椫呈約練觳餿橄宋廢赴腦鮒辰峁�。辶x希疲椋紓玻澹裕瑁邋澹潁澹螅酰歟翦澹錚駑澹幔睿酰歟酰簀澹媯椋猓潁錚螅酰簀澹悖澹歟戾澹穡潁錚歟椋媯澹潁幔簦椋錚鑠澹幔悖簦椋觶椋簦澹鰨澹潁邋澹簦澹螅翦澹猓澹裕瑁邋義希茫眩眨粒危藻澹悖澹歟戾澹穡潁錚歟椋媯澹潁幔簦椋錚鑠澹潁澹幔紓澹睿翦澹幔螅螅幔澹猓澹簦鰨澹澹鑠澹簦瑁邋澹簦瑁潁澹邋澹紓潁錚酰穡螅義希保矗澄藁嗑哿姿嵫味韻宋廢赴前肪厶牽ǎ牽粒牽┖銑傻撓跋戾義轄說南宋廢赴萌植煌ǘ齲

本文編號(hào)：2815736