在創(chuàng)面愈合過(guò)程中,表皮細(xì)胞發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其功能狀態(tài)深刻影響著創(chuàng)面愈合的質(zhì)量。而這其中,表皮細(xì)胞的增殖活性是影響創(chuàng)面愈合的重要機(jī)制之一。在表皮細(xì)胞的增殖過(guò)程中,諸多分子及信號(hào)通路參與了其增殖活性調(diào)控過(guò)程,其中鏈接黏附分子A(Junctional Adhesion Molecule A,JAM-A)近年來(lái)逐漸成為研究熱點(diǎn)。JAM-A是一種跨膜蛋白,屬于細(xì)胞間粘附分子家族,結(jié)構(gòu)中包含PDZ結(jié)構(gòu)域,同源二聚化后能夠與胞內(nèi)含PDZ結(jié)構(gòu)域的分子結(jié)合,發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。同時(shí),JAM-A本身是粘附分子,與細(xì)胞的粘附、遷移功能密切相關(guān),高表達(dá)于表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等多種細(xì)胞的膜表面,參與了上皮細(xì)胞屏障形成、調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥、血管新生等過(guò)程。據(jù)最新的研究顯示,除了調(diào)控細(xì)胞粘附、遷移以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)外,JAM-A還能夠正向調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖活性,在骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、睪丸癌、頭頸部鱗癌等惡性腫瘤中,JAM-A的表達(dá)均顯著提高,與癌細(xì)胞的增殖、侵襲、趨化等功能呈現(xiàn)出明顯的正向相關(guān)關(guān)系。而我們前期通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),干擾JAM-A表達(dá)后,表皮細(xì)胞增殖速度反而較高表達(dá)JAM-A的表皮細(xì)胞明顯加快。顯然,這與JAM-A在上述腫瘤組織中的功能是矛盾的,那JAM-A在正常表皮細(xì)胞中對(duì)增殖活性的調(diào)控到底是正向還是負(fù)向?此外,在這些腫瘤研究中,JAM-A表現(xiàn)出來(lái)的功能多是由蛋白來(lái)發(fā)揮的,鮮有學(xué)者關(guān)注其長(zhǎng)達(dá)3600bp、內(nèi)有大量非編碼RNA結(jié)合位點(diǎn)的3’UTR區(qū)域,那JAM-A在正常表皮細(xì)胞中對(duì)增殖活性的調(diào)控是否依然是其蛋白分子發(fā)揮主要作用?由于microRNA主要通過(guò)與靶分子mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用,所以我們猜想,JAM-A在正常表皮細(xì)胞中對(duì)增殖活性的調(diào)控是否也是通過(guò)microRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的?我們通過(guò)檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),miR-21、miR-31、miR-203、miR-205、miR-210等多種microRNA,參與了創(chuàng)面形成后表皮細(xì)胞增殖功能的調(diào)控。但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNA通過(guò)與JAM-A的3’UTR區(qū)結(jié)合調(diào)控細(xì)胞增殖。這提示我們,或許可以挖掘到與JAM-A 3’UTR區(qū)結(jié)合的新的miRNA。因此,根據(jù)以上JAM-A、microRNA與細(xì)胞增殖有關(guān)的研究進(jìn)展,結(jié)合我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們擬從非編碼RNA角度切入,在表皮細(xì)胞中深入探索JAM-A是否通過(guò)microRNA機(jī)制發(fā)揮與其在腫瘤細(xì)胞中相反的調(diào)控作用。我們擬在確認(rèn)預(yù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過(guò)高通量測(cè)序篩選差異表達(dá)的非編碼RNA,結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選潛在的非編碼RNA靶向識(shí)別結(jié)合的分子,探索JAM-A通過(guò)非編碼RNA調(diào)控下游增殖關(guān)鍵調(diào)控分子,進(jìn)而負(fù)向調(diào)控表皮細(xì)胞增殖功能的新機(jī)制。這將有助于更加深刻地理解創(chuàng)面愈合過(guò)程,為后續(xù)在糖尿病足、壓力性潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面中探索促愈合機(jī)制、尋找潛在的臨床治療靶向藥物奠定基礎(chǔ)。JAM-A影響表皮細(xì)胞增殖活性,過(guò)表達(dá)JAM-A抑制表皮細(xì)胞增殖,干擾JAM-A促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖據(jù)課題組前期研究顯示,干擾JAM-A表達(dá)后表皮細(xì)胞增殖速度加快,這與文獻(xiàn)報(bào)道的并不一致。為了明確JAM-A在表皮細(xì)胞中的對(duì)增殖活性的影響,我們用慢病毒作為載體,分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)JAM-A、干擾JAM-A的人永生化表皮細(xì)胞HaCaT,通過(guò)CCK-8和ki67實(shí)驗(yàn)證明,過(guò)表達(dá)JAM-A后表皮細(xì)胞增殖減慢,干擾JAM-A后表皮細(xì)胞增殖加快,與我們預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,與文獻(xiàn)報(bào)道JAM-A在腫瘤細(xì)胞中正性調(diào)控增殖功能相矛盾。JAM-A通過(guò)其mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合miR-221/222 cluster調(diào)控表皮細(xì)胞增殖功能的作用既往文獻(xiàn)報(bào)道,JAM-A在腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖中發(fā)揮作用,往往通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方式。我們通過(guò)PubMed網(wǎng)站Gene數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)JAM-A mRNA的3’UTR區(qū)有大量的microRNA結(jié)合位點(diǎn),并從miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)JAM-A3’UTR區(qū)能夠結(jié)合多條microRNA。因此,我們擬從microRNA的角度切入,探索JAM-A調(diào)控表皮細(xì)胞增殖功能的可能分子機(jī)制。為驗(yàn)證科學(xué)假設(shè),我們?cè)诟蓴_JAM-A表皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)CDS區(qū)、過(guò)表達(dá)3’UTR區(qū)的表皮細(xì)胞,通過(guò)PCR證明JAM-A調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞增殖活性是通過(guò)其3’UTR區(qū)。接下來(lái),我們?cè)O(shè)計(jì)了Dicer酶敲除實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步證明JAM-A是通過(guò)其3’UTR區(qū)與microRNA結(jié)合的方式來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞增殖的功效�；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),我們將過(guò)表達(dá)JAM-A、干擾JAM-A的表皮細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq高通量測(cè)序,結(jié)合生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)檢索,依據(jù)(1)在過(guò)表達(dá)組表達(dá)量明顯下調(diào)、(2)在干擾組明顯上調(diào)、(3)在細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)豐度2000TPM以上、(4)靶點(diǎn)與細(xì)胞增殖有關(guān)的microRNAs。經(jīng)過(guò)初篩,miR-221和miR-222完美符合上述標(biāo)準(zhǔn),不僅排名靠前,而且同屬一簇。通過(guò)RT-PCR,我們驗(yàn)證了干擾JAM-A后miR-221/222表達(dá)上調(diào),而過(guò)表達(dá)JAM-A 3’UTR區(qū)后miR-221/222表達(dá)下調(diào)。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們也證明了miR-221/222的擬似物促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖,抑制物抑制增殖。據(jù)此,miR-221/222 cluster確立為研究對(duì)象,JAM-A 3’UTR負(fù)向調(diào)控miR-221/222。miR-221/222 cluster同時(shí)靶向結(jié)合JAM-A、PTEN發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用目前研究顯示,microRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)識(shí)別結(jié)合,導(dǎo)致靶基因mRNA降解或者干擾其正常表達(dá),從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用。為進(jìn)一步闡明miRC在表皮細(xì)胞中發(fā)揮抑制增殖功能的分子機(jī)制,我們擬尋找與其功能吻合、直接識(shí)別結(jié)合的下游靶分子。通過(guò)對(duì)miRC靶分子的預(yù)測(cè)分析(microRNA.org、targetscan、miRbase)以及檢索PubMed和Web of Science等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),我們鎖定了PTEN為miR-221/222潛在的下游靶分子,并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了我們的設(shè)想,此外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)還進(jìn)一步證明了miR-221/222能夠同時(shí)靶向JAM-A和PTEN。接下來(lái),通過(guò)細(xì)胞和分子實(shí)驗(yàn),我們進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-221-3p、miR-222-5p的擬似物負(fù)向調(diào)控JAM-A和PTEN表達(dá),抑制物正向調(diào)控JAM-A和PTEN表達(dá),隨后又通過(guò)rescue實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-221-3p、miR-222-5p后能夠降低過(guò)表達(dá)JAM-A 3’UTR后PTEN的表達(dá)水平,進(jìn)一步證明了JAM-A mRNA保護(hù)PTEN免于被miR-221-3p/222-5p降解。JAM-A 3’UTR突變體對(duì)PTEN無(wú)調(diào)控作用,對(duì)表皮細(xì)胞增殖功能無(wú)抑制效果最后,我們探索了miR-221/222 cluster在JAM-A 3’UTR區(qū)具體的結(jié)合位點(diǎn)。由于miR-221在JAM-3’UTR區(qū)有3個(gè)結(jié)合位點(diǎn),在PTEN有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn),故而重點(diǎn)選擇miR-221-3p為主要研究對(duì)象�；贘AM-A 3’UTR區(qū)序列和miR-221-3p的3個(gè)結(jié)合位點(diǎn),我們分別構(gòu)建了各個(gè)位點(diǎn)突變體和全突變體質(zhì)粒,根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果,證明miR-221-3p與JAM-A 3’UTR區(qū)三個(gè)位點(diǎn)均可結(jié)合。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)皆以全突變體為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,分別通過(guò)RT-PCR和CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了JAM-A3’UTR突變體對(duì)PTEN無(wú)調(diào)控作用,對(duì)表皮細(xì)胞增殖活性無(wú)抑制效果。綜上所述,在本研究中,明確了JAM-A參與負(fù)向調(diào)控表皮細(xì)胞增殖活性,這種調(diào)控方式依賴(lài)于其mRNA的3’UTR區(qū),而非傳統(tǒng)的蛋白-蛋白間直接的相互作用,篩選得到了miR-221/222 cluster,并進(jìn)一步篩選得到miR-221/222的下游靶分子PTEN。隨后的機(jī)制研究中,我們明確了miR-221/222能夠同時(shí)靶向結(jié)合JAM-A和PTEN,闡明了miR-221/222具體的結(jié)合位點(diǎn),勾勒出JAM-A、miR-221/222 cluster、PTEN之間清晰的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。本課題對(duì)于從microRNA角度理解表皮細(xì)胞增殖活性的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了有益的探索,加深了對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中表皮細(xì)胞增殖功能的調(diào)控機(jī)制認(rèn)知,有利于將來(lái)針對(duì)性開(kāi)發(fā)促進(jìn)創(chuàng)面愈合的新藥。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R64
【部分圖文】：

pMIR-REPORTLuciferase示意圖

-27-圖 2 JAM-A 基因修飾的 HaCaT 細(xì)胞符合上皮細(xì)胞特點(diǎn)，同時(shí)表達(dá) GFP通過(guò)慢病毒感染人永生化表皮細(xì)胞 HaCaT，分別得到攜帶綠色熒光蛋白 GFP 的 JAM-AOVHaCaT、JAM-AKD HaCaT、慢病毒空載體 vector HaCaT 和 scramble HaCaT。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 3 天后，生長(zhǎng)融合至 90%，各組細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡觀察。在白光視野下，四組細(xì)胞形態(tài)符合上皮細(xì)胞特點(diǎn)，在綠色熒光視野下，四組細(xì)胞均表達(dá) GFP。四組細(xì)胞進(jìn)一步通過(guò)對(duì)角質(zhì)蛋白（KRT）進(jìn)行免疫熒光染色后，四組細(xì)胞在基因修飾后依然正常表達(dá)角質(zhì)蛋白，證明基因修飾并沒(méi)有改變 HaCaT 上皮細(xì)胞的性質(zhì)，并且慢病毒載體已經(jīng)進(jìn)入 HaCat 基因組，能夠正常表達(dá)目的蛋白和GFP。

-28-圖 3 敲除 JAM-A 后表皮細(xì)胞增殖明顯加快（A）CCK-8 實(shí)驗(yàn)證明 JAM-AKDHaCaT 細(xì)胞增殖最快，在第 3、5、7 天的檢測(cè)結(jié)果中均高于對(duì)照組 HaCaT 和 JAM-AOVHaCaT。（B）通過(guò)檢測(cè) JAM-AKD、JAM-AOV及對(duì)照組細(xì)胞中ki67 的表達(dá)情況證明 JAM-AKDHaCaT 細(xì)胞增殖速度最快。****，P＜0.0001，***，P＜0.001，** P＜0.01（2 way ANOVA），n=3。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 溫學(xué)輝;周智;;基層醫(yī)療創(chuàng)面治療基本原則[J];中華全科醫(yī)師雜志;2014年02期

本文編號(hào)：2814027