在創(chuàng)面愈合過程中,表皮細胞發(fā)揮著關鍵作用,其功能狀態(tài)深刻影響著創(chuàng)面愈合的質量。而這其中,表皮細胞的增殖活性是影響創(chuàng)面愈合的重要機制之一。在表皮細胞的增殖過程中,諸多分子及信號通路參與了其增殖活性調控過程,其中鏈接黏附分子A(Junctional Adhesion Molecule A,JAM-A)近年來逐漸成為研究熱點。JAM-A是一種跨膜蛋白,屬于細胞間粘附分子家族,結構中包含PDZ結構域,同源二聚化后能夠與胞內含PDZ結構域的分子結合,發(fā)揮信號轉導功能。同時,JAM-A本身是粘附分子,與細胞的粘附、遷移功能密切相關,高表達于表皮細胞、內皮細胞、炎癥細胞、間充質干細胞等多種細胞的膜表面,參與了上皮細胞屏障形成、調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥、血管新生等過程。據(jù)最新的研究顯示,除了調控細胞粘附、遷移以及信號轉導外,JAM-A還能夠正向調控腫瘤細胞的增殖活性,在骨髓瘤、乳腺癌、肺癌、睪丸癌、頭頸部鱗癌等惡性腫瘤中,JAM-A的表達均顯著提高,與癌細胞的增殖、侵襲、趨化等功能呈現(xiàn)出明顯的正向相關關系。而我們前期通過預實驗發(fā)現(xiàn),干擾JAM-A表達后,表皮細胞增殖速度反而較高表達JAM-A的表皮細胞明顯加快。顯然,這與JAM-A在上述腫瘤組織中的功能是矛盾的,那JAM-A在正常表皮細胞中對增殖活性的調控到底是正向還是負向?此外,在這些腫瘤研究中,JAM-A表現(xiàn)出來的功能多是由蛋白來發(fā)揮的,鮮有學者關注其長達3600bp、內有大量非編碼RNA結合位點的3’UTR區(qū)域,那JAM-A在正常表皮細胞中對增殖活性的調控是否依然是其蛋白分子發(fā)揮主要作用?由于microRNA主要通過與靶分子mRNA的3’UTR區(qū)結合發(fā)揮轉錄后抑制作用,所以我們猜想,JAM-A在正常表皮細胞中對增殖活性的調控是否也是通過microRNA來實現(xiàn)的?我們通過檢索文獻發(fā)現(xiàn),miR-21、miR-31、miR-203、miR-205、miR-210等多種microRNA,參與了創(chuàng)面形成后表皮細胞增殖功能的調控。但目前尚無文獻報道m(xù)icroRNA通過與JAM-A的3’UTR區(qū)結合調控細胞增殖。這提示我們,或許可以挖掘到與JAM-A 3’UTR區(qū)結合的新的miRNA。因此,根據(jù)以上JAM-A、microRNA與細胞增殖有關的研究進展,結合我們預實驗結果,我們擬從非編碼RNA角度切入,在表皮細胞中深入探索JAM-A是否通過microRNA機制發(fā)揮與其在腫瘤細胞中相反的調控作用。我們擬在確認預實驗現(xiàn)象的基礎上,進一步通過高通量測序篩選差異表達的非編碼RNA,結合生物信息學分析篩選潛在的非編碼RNA靶向識別結合的分子,探索JAM-A通過非編碼RNA調控下游增殖關鍵調控分子,進而負向調控表皮細胞增殖功能的新機制。這將有助于更加深刻地理解創(chuàng)面愈合過程,為后續(xù)在糖尿病足、壓力性潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面中探索促愈合機制、尋找潛在的臨床治療靶向藥物奠定基礎。JAM-A影響表皮細胞增殖活性,過表達JAM-A抑制表皮細胞增殖,干擾JAM-A促進表皮細胞增殖據(jù)課題組前期研究顯示,干擾JAM-A表達后表皮細胞增殖速度加快,這與文獻報道的并不一致。為了明確JAM-A在表皮細胞中的對增殖活性的影響,我們用慢病毒作為載體,分別構建了過表達JAM-A、干擾JAM-A的人永生化表皮細胞HaCaT,通過CCK-8和ki67實驗證明,過表達JAM-A后表皮細胞增殖減慢,干擾JAM-A后表皮細胞增殖加快,與我們預實驗結果一致,與文獻報道JAM-A在腫瘤細胞中正性調控增殖功能相矛盾。JAM-A通過其mRNA的3’UTR區(qū)結合miR-221/222 cluster調控表皮細胞增殖功能的作用既往文獻報道,JAM-A在腫瘤細胞的遷移、增殖中發(fā)揮作用,往往通過蛋白質-蛋白質相互作用的方式。我們通過PubMed網站Gene數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)JAM-A mRNA的3’UTR區(qū)有大量的microRNA結合位點,并從miRNA數(shù)據(jù)庫中預測JAM-A3’UTR區(qū)能夠結合多條microRNA。因此,我們擬從microRNA的角度切入,探索JAM-A調控表皮細胞增殖功能的可能分子機制。為驗證科學假設,我們在干擾JAM-A表皮細胞的基礎上,分別構建了過表達CDS區(qū)、過表達3’UTR區(qū)的表皮細胞,通過PCR證明JAM-A調節(jié)表皮細胞增殖活性是通過其3’UTR區(qū)。接下來,我們設計了Dicer酶敲除實驗,進一步證明JAM-A是通過其3’UTR區(qū)與microRNA結合的方式來發(fā)揮調節(jié)表皮細胞增殖的功效�；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),我們將過表達JAM-A、干擾JAM-A的表皮細胞進行RNA-seq高通量測序,結合生物信息學分析和文獻檢索,依據(jù)(1)在過表達組表達量明顯下調、(2)在干擾組明顯上調、(3)在細胞內基礎豐度2000TPM以上、(4)靶點與細胞增殖有關的microRNAs。經過初篩,miR-221和miR-222完美符合上述標準,不僅排名靠前,而且同屬一簇。通過RT-PCR,我們驗證了干擾JAM-A后miR-221/222表達上調,而過表達JAM-A 3’UTR區(qū)后miR-221/222表達下調。通過體外細胞實驗,我們也證明了miR-221/222的擬似物促進表皮細胞增殖,抑制物抑制增殖。據(jù)此,miR-221/222 cluster確立為研究對象,JAM-A 3’UTR負向調控miR-221/222。miR-221/222 cluster同時靶向結合JAM-A、PTEN發(fā)揮轉錄后抑制作用目前研究顯示,microRNA主要通過與靶基因mRNA的3’UTR區(qū)識別結合,導致靶基因mRNA降解或者干擾其正常表達,從而發(fā)揮轉錄后抑制作用。為進一步闡明miRC在表皮細胞中發(fā)揮抑制增殖功能的分子機制,我們擬尋找與其功能吻合、直接識別結合的下游靶分子。通過對miRC靶分子的預測分析(microRNA.org、targetscan、miRbase)以及檢索PubMed和Web of Science等文獻數(shù)據(jù)庫,我們鎖定了PTEN為miR-221/222潛在的下游靶分子,并通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了我們的設想,此外雙熒光素酶報告基因實驗還進一步證明了miR-221/222能夠同時靶向JAM-A和PTEN。接下來,通過細胞和分子實驗,我們進一步驗證了miR-221-3p、miR-222-5p的擬似物負向調控JAM-A和PTEN表達,抑制物正向調控JAM-A和PTEN表達,隨后又通過rescue實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-221-3p、miR-222-5p后能夠降低過表達JAM-A 3’UTR后PTEN的表達水平,進一步證明了JAM-A mRNA保護PTEN免于被miR-221-3p/222-5p降解。JAM-A 3’UTR突變體對PTEN無調控作用,對表皮細胞增殖功能無抑制效果最后,我們探索了miR-221/222 cluster在JAM-A 3’UTR區(qū)具體的結合位點。由于miR-221在JAM-3’UTR區(qū)有3個結合位點,在PTEN有2個結合位點,故而重點選擇miR-221-3p為主要研究對象。基于JAM-A 3’UTR區(qū)序列和miR-221-3p的3個結合位點,我們分別構建了各個位點突變體和全突變體質粒,根據(jù)雙熒光素酶報告基因實驗的結果,證明miR-221-3p與JAM-A 3’UTR區(qū)三個位點均可結合。因此,后續(xù)實驗皆以全突變體為實驗對象,分別通過RT-PCR和CCK-8實驗驗證了JAM-A3’UTR突變體對PTEN無調控作用,對表皮細胞增殖活性無抑制效果。綜上所述,在本研究中,明確了JAM-A參與負向調控表皮細胞增殖活性,這種調控方式依賴于其mRNA的3’UTR區(qū),而非傳統(tǒng)的蛋白-蛋白間直接的相互作用,篩選得到了miR-221/222 cluster,并進一步篩選得到miR-221/222的下游靶分子PTEN。隨后的機制研究中,我們明確了miR-221/222能夠同時靶向結合JAM-A和PTEN,闡明了miR-221/222具體的結合位點,勾勒出JAM-A、miR-221/222 cluster、PTEN之間清晰的關系網絡。本課題對于從microRNA角度理解表皮細胞增殖活性的調控機制進行了有益的探索,加深了對創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞增殖功能的調控機制認知,有利于將來針對性開發(fā)促進創(chuàng)面愈合的新藥。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R64
【部分圖文】：

pMIR-REPORTLuciferase示意圖

-27-圖 2 JAM-A 基因修飾的 HaCaT 細胞符合上皮細胞特點，同時表達 GFP通過慢病毒感染人永生化表皮細胞 HaCaT，分別得到攜帶綠色熒光蛋白 GFP 的 JAM-AOVHaCaT、JAM-AKD HaCaT、慢病毒空載體 vector HaCaT 和 scramble HaCaT。細胞繼續(xù)培養(yǎng) 3 天后，生長融合至 90%，各組細胞置于熒光倒置顯微鏡觀察。在白光視野下，四組細胞形態(tài)符合上皮細胞特點，在綠色熒光視野下，四組細胞均表達 GFP。四組細胞進一步通過對角質蛋白（KRT）進行免疫熒光染色后，四組細胞在基因修飾后依然正常表達角質蛋白，證明基因修飾并沒有改變 HaCaT 上皮細胞的性質，并且慢病毒載體已經進入 HaCat 基因組，能夠正常表達目的蛋白和GFP。

-28-圖 3 敲除 JAM-A 后表皮細胞增殖明顯加快（A）CCK-8 實驗證明 JAM-AKDHaCaT 細胞增殖最快，在第 3、5、7 天的檢測結果中均高于對照組 HaCaT 和 JAM-AOVHaCaT。（B）通過檢測 JAM-AKD、JAM-AOV及對照組細胞中ki67 的表達情況證明 JAM-AKDHaCaT 細胞增殖速度最快。****，P＜0.0001，***，P＜0.001，** P＜0.01（2 way ANOVA），n=3。

【參考文獻】

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1 溫學輝;周智;;基層醫(yī)療創(chuàng)面治療基本原則[J];中華全科醫(yī)師雜志;2014年02期

本文編號：2814027