研究背景樹突狀細胞作為一種專職的抗原提呈細胞,其能夠?qū)乖煞诌M行吞噬、加工和處理并將處理后的抗原呈遞于細胞表面,從而對免疫系統(tǒng)內(nèi)的其它細胞進行抗原提呈。由于樹突狀細胞所具有的這種特殊作用,由其制備而成的治療性腫瘤疫苗已經(jīng)被逐漸應(yīng)用于人類腫瘤性疾病的治療。然而,研究發(fā)現(xiàn)處于腫瘤環(huán)境中的未成熟樹突狀細胞并不具有有效的抗原提呈功能。為了克服這一限制,較為常用的方法是通過體外培養(yǎng)骨髓細胞從而獲得未成熟的樹突狀細胞,隨后使用腫瘤特異性抗原物質(zhì)對未成熟的樹突狀細胞進行激活,使這些細胞能夠在促炎性刺激物的誘導下逐漸成熟。目前,針對人類腫瘤性疾病的實驗性免疫治療當中有許多都是基于樹突狀細胞的腫瘤疫苗免疫療法,而這些實驗性治療中所使用的樹突狀細胞均為來自于患者自身的自體樹突狀細胞。對于以樹突狀細胞為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗免疫治療實驗而言,其作用機制與臨床治療具有強烈的相關(guān)性,并且這些治療方法有望在將來被逐漸應(yīng)用于臨床,從而為腫瘤患者的系統(tǒng)性治療帶來新的方法。然而,到目前為止,相關(guān)的臨床試驗結(jié)果并來顯示出良好的整體治療效果,樹突狀細胞腫瘤疫苗的療效僅僅局限于少數(shù)患者。由于進入機體內(nèi)的樹突狀細胞腫瘤疫苗需要到達次級淋巴器官或淋巴組織內(nèi)才能有效地激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng),所以疫苗是否能夠成功遷移至機體的次級淋巴器官或淋巴組織將極大的影響免疫治療的有效性。樹突狀細胞腫瘤疫苗的注射路徑和注射頻率以及注射的細胞數(shù)量均與有活力的樹突狀細胞在機體內(nèi)的遷移效率存在強烈的相關(guān)性,并且這些因素也能夠?qū)﹄S后的治療結(jié)果產(chǎn)生決定性的影響。目前,對于樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備和應(yīng)用尚未有統(tǒng)一的標準被建立。盡管相關(guān)的研究已經(jīng)表明體外條件下制備腫瘤特異性抗原致敏的樹突狀細胞腫瘤疫苗是一種可行且有效的方法,但是對于腫瘤疫苗的最佳注射路徑這一問題卻仍然存在著較大的爭議。考慮到機體的腹腔內(nèi)存在有大量的引流淋巴結(jié)以及脾臟這個最大的淋巴器官,從理論上而言,腹腔注射樹突狀細胞腫瘤疫苗應(yīng)當是一種可行且有效的治療方式。然而迄今為止尚很少有腹腔注射樹突狀細胞腫瘤疫苗的相關(guān)報道來支持這一觀點,因此這種治療方式的有效性以及治療效率仍需進一步的動物實驗來證實。鑒于以上研究現(xiàn)狀,本實驗準備在以往的樹突狀細胞體外培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上探索一種更為有效的樹突狀細胞獲取以及體外培養(yǎng)的方法,并通過小鼠體內(nèi)試驗來研究腹腔注射方式是否能夠促進樹突狀細胞向引流淋巴結(jié)、淋巴組織和淋巴器官的遷移。此外,本實驗擬通過骨肉瘤小鼠模型的體內(nèi)試驗來研究腹腔注射樹突狀細胞腫瘤疫苗在骨肉瘤治療方面的有效性,從而為骨肉瘤的臨床治療提供一種新的思路。第一部分樹突狀細胞腹腔淋巴結(jié)內(nèi)遷移-骨肉瘤免疫治療的機制研究目的:在以往研究的基礎(chǔ)上探索更有效的樹突狀細胞獲取以及體外培養(yǎng)的方法并通過使用健康的小鼠作為動物模型來研究經(jīng)腹腔注射途徑給予樹突狀細胞的方法是否能夠促進樹突狀細胞在小鼠體內(nèi)的吸收以及遷移。方法:通過沖洗C57BL/6小鼠股骨和脛骨骨髓腔的方法獲取骨髓細胞,使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)并向培養(yǎng)液中加入終濃度為10ng/ml的 rm-GM-CSF、1ng/ml的 rm-IL-4、100 單位/ml 的青霉素、100μg/ml的鏈霉素以及0.25 μg/ml的兩性霉素B,從而促使骨髓細胞中的樹突狀細胞前體細胞向未成熟的樹突狀細胞分化。在細胞培養(yǎng)的第7天時,向細胞培養(yǎng)液中加入終濃度為100 ng/ml的IFN-γ、250ng/ml的LPS以及20 ng/ml的TNF-α,使未成熟的樹突狀細胞向成熟的樹突狀細胞轉(zhuǎn)化,繼續(xù)培養(yǎng)1天后即可獲得成熟的骨髓來源樹突狀細胞。隨后使用流式細胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)8天后的骨髓細胞中 CD11c、CD11b、CD40、CD86、CD80、H-2Db、H-2Kb 以及MHC Ⅱ分子的表達情況,從而明確樹突狀細胞的純度和成熟度。通過向小鼠腹腔內(nèi)注射墨汁,觀察小鼠腹腔內(nèi)淋巴結(jié)和淋巴組織的分布以及墨汁染色情況;向小鼠腹腔內(nèi)注射PKH26紅色熒光染料標記的成熟樹突狀細胞,隨后獲取小鼠脾臟、胰腺以及腸道和周圍組織,采用石蠟切片、冰凍切片、HE染色、DAPI染色、光學顯微鏡觀察以及熒光顯微鏡觀察等方法,檢測相應(yīng)組織中樹突狀細胞的含量。結(jié)果:1.每只小鼠的骨髓組織中可以獲得的細胞總數(shù)為1.0-1.2 x 107個;經(jīng)過8天的體外細胞培養(yǎng)后,可以獲得的成熟樹突狀細胞總數(shù)為1-2x108個。與以往的實驗相比,本實驗獲取的骨髓細胞數(shù)量和成熟樹突狀細胞數(shù)量均明顯增多。此外,在細胞培養(yǎng)的第1天至第7天的過程中,光鏡下能夠觀察到具有典型樹突狀細胞特點的骨髓來源細胞的動態(tài)發(fā)育過程。2.流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)8天后的骨髓來源細胞能夠大量地表達CD11c、CD11b、CD40、CD86、CD80、H-2Db、H-2Kb 以及 MHC Ⅱ這些能夠代表樹突狀細胞成熟的標志物,表明本實驗所獲得的小鼠骨髓來源細胞中的樹突狀細胞純度相對較高,并且成熟的樹突狀細胞在所有細胞中所占的比例也較大。3.腹腔注射墨汁30分鐘以后,小鼠腹腔內(nèi)的淋巴結(jié)和淋巴管能夠在肉眼下被直接辨認。HE染色切片顯示,腹腔內(nèi)的淋巴器官能夠顯著的吸收墨汁。4.熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小鼠的脾臟、胰腺和腸道的冰凍組織切片內(nèi)均有紅色熒光標記的成熟樹突狀細胞存在。ImageJ軟件量化脾臟內(nèi)樹突狀細胞數(shù)量百分比,結(jié)果顯示腹腔注射以后在不同時間點上測得的樹突狀細胞數(shù)量百分比之間無顯著性差異。結(jié)論:通過本實驗所使用的樹突狀細胞體外培養(yǎng)方法能夠獲得大量成熟的小鼠骨髓來源樹突狀細胞。此外,腹腔注射的成熟樹突狀細胞在小鼠腹腔內(nèi)表現(xiàn)出良好的吸收和遷移效率。第二部分樹突狀細胞腫瘤疫苗免疫治療小鼠骨肉瘤的體內(nèi)試驗研究目的:研究腹腔注射途徑給予樹突狀細胞腫瘤疫苗是否能夠在骨肉瘤小鼠模型體內(nèi)引起有效的腫瘤特異性細胞毒性T細胞反應(yīng)以及該方法是否能夠成為一種治療小鼠骨肉瘤的有效手段。方法:制作C3H小鼠骨肉瘤模型,采用背部皮下注射2x106個LM8骨肉瘤細胞的方法并將小鼠隨機分為對照組和實驗組。樹突狀細胞腫瘤疫苗的制備以及腹腔注射樹突狀細胞腫瘤疫苗的方法如下:通過中波紫外線照射法制備LM8骨肉瘤細胞裂解產(chǎn)物,將腫瘤細胞裂解產(chǎn)物與體外培養(yǎng)的C3H小鼠骨髓細胞共同培養(yǎng)從而獲得腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞腫瘤疫苗。在實驗的第14天、21天和28天分別向治療組小鼠腹腔內(nèi)注射一次樹突狀細胞腫瘤疫苗(1.5ml含有5 x 106個細胞的PBS液),同時向?qū)φ战M小鼠腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水。每組小鼠按照觀察時間隨機分為7天、21天和35天三個亞組。在實驗的第7天、21天和35天分別處死相應(yīng)亞組的小鼠,并且記錄每只被處死小鼠體內(nèi)腫瘤的體積以驗證腫瘤疫苗治療骨肉瘤的效果。此外,分別獲取健康小鼠、使用未致敏的樹突狀細胞進行治療的荷瘤小鼠和使用致敏的樹突狀細胞進行治療的荷瘤小鼠的脾臟,使用CD8a陽性T細胞分離試劑盒和LS柱對脾臟內(nèi)的CD8a陽性T細胞進行分離純化。隨后使用標準的乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒對純化后的三組CD8陽性T細胞進行細胞毒性檢測。最后,制備對照組與治療組小鼠骨肉瘤的組織切片并進行TUNEL染色,隨后對染色圖像進行精確的量化分析以檢測腫瘤細胞的凋亡情況。結(jié)果:1.通過計算各亞組小鼠腫瘤體積的平均數(shù)與標準差并繪制腫瘤的生長曲線發(fā)現(xiàn),與對照組相比,樹突狀細胞腫瘤疫苗治療組的腫瘤生長受到了明顯的抑制(P0.0001)。2.體外細胞毒性試驗發(fā)現(xiàn),腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞腫瘤疫苗治療組的T細胞所產(chǎn)生的細胞毒性明顯強于原始T細胞所產(chǎn)生的細胞毒性。腫瘤抗原致敏的樹突狀細胞腫瘤疫苗治療組的T細胞所產(chǎn)生的細胞毒性明顯強于未致敏的樹突狀細胞治療組的T細胞所產(chǎn)生的細胞毒性。隨著T細胞與腫瘤細胞的比例逐漸增大,CD8陽性T細胞所產(chǎn)生的細胞毒活性也逐漸增大。體外細胞毒性試驗的結(jié)果與體內(nèi)試驗的治療效果是一致的。3.TUNEL染色結(jié)果顯示,樹突狀細胞腫瘤疫苗能夠在治療組小鼠體內(nèi)誘導細胞凋亡的出現(xiàn)。根據(jù)HistoQuest軟件分析的結(jié)果顯示,在實驗的第7天時,兩組小鼠的凋亡指數(shù)基本處于同一水平,兩組結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.7650);在實驗的第21天時,實驗組小鼠的凋亡指數(shù)明顯高于對照組小鼠的凋亡指數(shù),兩組結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.0001);在實驗的第35天時,實驗組小鼠的凋亡指數(shù)也明顯高于對照組小鼠的凋亡指數(shù),兩組結(jié)果之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.0001)。結(jié)論:通過腹腔注射途徑給予大劑量的治療性樹突狀細胞腫瘤疫苗進行抗腫瘤免疫治療能夠在小鼠體內(nèi)引起有效的腫瘤特異性細胞毒性T細胞反應(yīng)并有效的抑制小鼠體內(nèi)骨肉瘤的生長。由于這種治療方法具有被直接轉(zhuǎn)換到臨床骨肉瘤治療當中的可能,因此該方法在未來有望成為繼手術(shù)治療與新輔助化療之后治療人類骨肉瘤的又一有效手段。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R738.1
【部分圖文】：

Ｂｏｎｅｓ邋ｍａｒｒｏｗｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ邐Ｒｅｄ邋ｂｌｏｏｄ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｒｅ邋ｌｙｓｅｄ邐Ｃｅｌｌｓ邋ａｒｅ邋ｐｌａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｐｅｔｒｉ邋ｄｉｓｈ逡逑圖３．小鼠骨髓組織的獲取和培養(yǎng)。（Ａ）使用二氧化碳窒息法處死小逡逑鼠；（Ｂ）仔細解剖并完整分離小鼠股骨和脛骨（去除周圍肌肉和軟組織）；逡逑（Ｃ）從長骨中部將其剪斷（保留遠端完整性）并使用細胞培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，逡逑

４ｔｈ邋ｄａｙ邐５ｔｈ邋ｄａｙ邐６ｔｈ邋ｄａｙ邐７ｔｈ邋ｄａｙ逡逑圖４．小鼠骨髓來源樹突狀細胞體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)學變化。使用光學逡逑顯微鏡記錄小鼠骨髓細胞培養(yǎng)過程中每天發(fā)生的形態(tài)學變化：（Ａ）體外培養(yǎng)逡逑前的骨髓細胞為圓形單細胞形態(tài)；（Ｂ）細胞培養(yǎng)的第１天，骨髓細胞仍為單細逡逑

圖５．小鼠骨髓來源樹突狀細胞的流式細胞術(shù)分析結(jié)果。（Ａ－Ｂ）收集體逡逑外培養(yǎng)８天后的樹突狀細胞并進行流式細胞術(shù)檢測，選擇ＣＤ１邋ｌｃ和ＣＤｌ邋ｌｂ作為逡逑樹突狀細胞的特異性標志物，同時選擇ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩ、Ｈ－２Ｄｂ逡逑和Ｈ－２Ｋｂ作為樹突狀細胞成熟度的標志物。（Ｃ）樹突狀細胞表面標志物表達逡逑

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