【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?①探討MECM基水凝膠促進(jìn)半月板纖維軟骨細(xì)胞(Meniscus FibrochondrocytesMFCs)增殖和維持MFCs表型的能力;②MECM基水凝膠復(fù)合3D打印支架構(gòu)建組3D打印半月板復(fù)合支架,并評價(jià)該復(fù)合支架的生物相容性及生物力學(xué)強(qiáng)度;③研究該支架修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)半月板缺損的效果。實(shí)驗(yàn)方法:①以脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)(decellularized meniscus extracellular matrix DMECM)和海藻酸鈉為原料,制備5種不同濃度(0%,0.5%,1%,2%,4%)的MECM基水凝膠;②MECM基水凝膠復(fù)合P3代MFCs體外培養(yǎng)1、4、7、14d,通過死活染色、CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、DNA定量、膠原定量、糖胺多糖(glycosaminoglycan GAG)定量和RT-PCR實(shí)驗(yàn)評估MECM基水凝膠促進(jìn)MFCs增殖和維持MFCs表型的能力;③以聚己內(nèi)醋(Poly(epsilon-caprolactone)PCL)為原料,結(jié)合3D打印技術(shù)構(gòu)建仿生天然半月板膠原纖維排列的取向性支架,經(jīng)過堿蝕刻材料表面處理后復(fù)合MECM基水凝膠構(gòu)建3D打印半月板復(fù)合支架;通過CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)、大鼠皮下免疫排斥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(1周,1月)、生物力學(xué)測試評價(jià)支架的生物相容性及生物力學(xué)性能;④選取4-6月齡骨骼成熟的健康新西蘭大白兔,構(gòu)建左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板缺損動(dòng)物模型,隨機(jī)均分為5組:假手術(shù)組(A組),復(fù)合支架/細(xì)胞組(B組),復(fù)合支架(C組),單純支架組(D組)及空白對照組(E組),每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只,于術(shù)后3月、6月兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材,分別對修復(fù)組織行大體觀察、組織學(xué)、分子生物學(xué)、生物力學(xué)分析和影像學(xué)評估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①1、4、7、14d膠原定量、GAG定量和RT-PCR結(jié)果證實(shí)MECM基水凝膠均能很好的維持細(xì)胞表型,其中2%濃度組效果最好;DNA定量和CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)MECM基水凝膠均能促進(jìn)MFCs的增殖,其中2%濃度組作用效果最強(qiáng);②CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)、大鼠皮下免疫排斥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)3D打印復(fù)合支架具有良好的生物相容性;③生物力學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)3D打印復(fù)合支架力學(xué)性能優(yōu)于單純PCL支架,接近于天然半月板;④術(shù)后3月、6月取材,大體觀:A組半月板組織正常,無破壞,B、C、D三組均可見新月形新生半月板樣組織形成,B組明顯優(yōu)于C和D組,E組僅有少量滑膜增生,未見半月板樣組織形成,B、C、D組6個(gè)月時(shí)間點(diǎn)再生半月板樣組織均明顯優(yōu)于3個(gè)月時(shí)間點(diǎn);A組脛骨平臺及股骨髁軟骨表面光滑無磨損,B、C、D組脛骨平臺和股骨髁軟骨有不同程度的磨損,B組只見輕微磨損,明顯優(yōu)于C和D組,E組脛骨平臺和股骨髁軟骨磨損嚴(yán)重,可見骨贅形成和骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis OA)表現(xiàn);⑤組織學(xué)染色結(jié)果顯示:B組新生組織甲苯胺藍(lán),番紅O和天狼猩紅染色強(qiáng)陽性,接近于A組,明顯優(yōu)于C組及D組,A組關(guān)節(jié)軟骨正常,B組關(guān)節(jié)軟骨磨損較輕,明顯優(yōu)于C、D、E組;⑥生物力學(xué)檢測結(jié)果顯示:B組拉伸模量和壓縮模量均優(yōu)于C組和D組,接近于A組;⑦新生組織GAG和膠原定量結(jié)果顯示,B組GAG和膠原含量均高于C組和D組,接近于A組。⑧膝關(guān)節(jié)影像學(xué)(X線和磁共振)顯示:A組膝關(guān)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,B組可見新生半月板樣組織形成,軟骨無明顯破壞,C組和D組同樣可見半月板樣組織,形態(tài)明顯小于B組,軟骨有不同程度破壞;E組無新生半月板組織形成,成O A樣改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:MECM基水凝膠復(fù)合3D打印支架構(gòu)建的3D打印半月板復(fù)合支架能促進(jìn)MFCs增殖,維持MFCs表型,具有很好的生物相容性和良好的生物力學(xué)性能,能有效地修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)半月板缺損,促進(jìn)半月板的再生。因此MECM基水凝膠復(fù)合3D打印支架構(gòu)建的3D打印半月板復(fù)合支架在未來組織工程半月板修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R687.4;R318.08
【圖文】：

一、ＭＥＣＭ脫細(xì)胞前后的比較逡逑Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８熒光染色結(jié)果顯示ＤＭＥＣＭ未見明顯ＤＮＡ核酸物質(zhì)殘留，同樣逡逑ＨＥ染色也可以看出ＤＭＥＣＭ材料中未見細(xì)胞核成分，進(jìn)一步的殘余ＤＮＡ定量測定逡逑結(jié)果顯示幾乎全部的ＤＮＡ物質(zhì)得到去除。逡逑甲苯胺藍(lán)染色和番紅０染色結(jié)果顯示ＭＥＣＭ脫細(xì)胞前后染色無明顯區(qū)別，提逡逑示脫細(xì)胞過程中ＧＡＧ成分得到很好的保留；進(jìn)一步的ＧＡＧ定量測定結(jié)果顯示逡逑ＤＭＥＣＭ保留大量的的ＧＡＧ成分。逡逑天狼猩紅染色顯示ＭＥＣＭ脫細(xì)胞前后染色無明顯差異，提示脫細(xì)胞過程中膠逡逑原成分得到很好的保留，進(jìn)一步膠原定量測定結(jié)果顯示脫細(xì)胞前后，膠原成分無逡逑顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示脫細(xì)胞過程沒有造成膠原有效成分的丟失。逡逑＂＂

邋ＱＭＫＭ邐ＤＭ５ＣＭ逡逑圖１－２天然半月板組織和ＤＭＥＣＭ組織學(xué)和成分分析（＊表示兩組支架的比較Ｐ＜０．０５，邋＊＊表示逡逑兩組支架的比較Ｐ＜０．０１）逡逑１６逡逑

解放軍醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文逡逑ＣＣＫ－８細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖１－６）顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，不同濃度的逡逑ＭＥＣＭ基水凝膠的ＯＤ４５Ｃ值均呈現(xiàn)不同程度的遞增趨勢，提示ＭＥＣＭ基水凝膠具逡逑有良好的細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞的增殖；其中第４、７和１４ｄ時(shí)，可見２％濃度組逡逑ＯＤ４５（）值明顯高于其他組，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＜０．０５），表明２％ＭＥＣＭ基水逡逑凝膠較其他濃度的水凝膠能更好促進(jìn)ＭＦＣｓ的增殖。逡逑ｆ２５＿邐ｊ逡逑ｇ邋３邐Ｊｊ逡逑兮邐＾邋０．５＾邐｜邐ｒ逡逑ｇ邋２，０－邋Ｓ邋１％邐Ｊ邐自逡逑Ｉ邋１－５－邐＾邋４％邐＊邐｜｜｜邋Ｉ逡逑ｊ：；＾邋ｉｉｉ邋ｉｌｌ邋１１１逡逑＜邐Ｄａｙ１邋Ｄａｙ４邋Ｄａｙ７邋Ｄａｙ１４逡逑Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ邋ｔｉｍ？逡逑圖１－６邋ＣＣＫ－８細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（＊表示同一時(shí)間點(diǎn)與其他各組之間的比較Ｐ＜０．０５）逡逑ＤＮＡ含量測定結(jié)果顯示（圖１－７），不同濃度的ＭＥＣＭ基水凝膠隨著培養(yǎng)時(shí)逡逑間的增加，ＤＮＡ含量均逐漸增加，提示ＭＦＣｓ在不同濃度的ＭＥＣＭ基水凝膠中均逡逑能不斷增殖；其中２％濃度組在不同時(shí)間點(diǎn)ＤＮＡ含量均高于其他組，有顯著性統(tǒng)逡逑計(jì)學(xué)差異（Ｐ＜邋０．０５）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郭維民;劉舒云;高鉞;黃靖香;彭江;汪愛媛;王玉;盧世璧;郭全義;;脫細(xì)胞半月板細(xì)胞外基質(zhì)對半月板細(xì)胞的影響[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2015年03期

本文編號：2801409