【摘要】：組織工程學的出現(xiàn)為組織損傷或機體創(chuàng)傷提供了一種組織再生的技術手段,將改變外科傳統(tǒng)的“以創(chuàng)傷修復創(chuàng)傷”的治療模式,從而使臨床對損傷的治療邁入無創(chuàng)修復的新階段。對于組織工程組織的構建,目前最為重要的細胞是骨髓基質干細胞(BMSCs)和內皮細胞(EC)。BMSCs作為最廣泛使用的種子細胞提供了組織構建的始動因素,體外培養(yǎng)帶有細胞活性的生物材料并移植入體內,使得修復復雜創(chuàng)傷成為可能,同時內皮細胞作為組織工程血管化的承擔者和執(zhí)行者,如何快速激活靜止的內皮細胞,及早完成植入體內組織的血管化階段,對組織工程來說具有十分重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs發(fā)揮修復損傷的器官和組織的治療作用是通過多靶點和多重作用機制。BMSCs能夠分泌多種旁分泌因子,包括細胞因子、趨化因子以及營養(yǎng)因子等作用于不同細胞,發(fā)揮不同的調節(jié)作用。BMSCs復合材料移植入體內后,引起血管的長入,從而加速創(chuàng)傷的修復進程。然而目前尚缺乏其機制方面的研究。BMSCs能否能夠通過旁分泌作用分泌某些因子作用于EC,以及通過什么樣的途徑調節(jié)EC進而促進其血管生成能力增加。這方面的探索對組織工程血管化有重要的價值。本研究第一部分利用BMSCs和RAOEC兩種細胞,采用間接共培養(yǎng)體系模擬兩種細胞的相互作用,并進一步探究BMSCs的旁分泌作用對EC產生的生物學影響,同時對共培養(yǎng)產生的細胞上清液中外泌體進行TMT蛋白定量檢測,為后續(xù)的機制研究指明方向,結果顯示BMSCs能夠對RAOEC的增殖、凋亡、遷移、侵襲和成血管能力產生影響,并且外泌體生物信息學結果初步表明了BMSCs能夠影響RAOEC與細胞外基質結合、粘附以及細胞內的信號通路的轉導,篩選出的差異蛋白也為下一步的研究提供了基礎。本課題組致力于骨組織工程的研究,通過構建骨缺損動物模型,在特定的觀察時間段內,觀察骨缺損的修復效果。在基礎研究中多數(shù)實驗研究對骨缺損的修復效果評估仍停留在組織學評估階段,如HE染色、免疫組化和影像學等,反映的是骨損傷后修復過程中無機鹽及膠原成分的累積程度。骨骼具有重要的生理功能,如運動、負重和保護內臟等,均與骨的力學性質密切相關,尤其對于長段骨來說。因此骨的質量和性能的恢復程度必須以骨的生物力學功能的恢復為標準。在基礎研究中,EGFP轉基因大鼠常被用作動物模型的構建、種子細胞的提取和報告基因的示蹤等,然而作為一種動物模型,其骨缺損修復的能力尚未見報道。本研究第二部分通過制備野生型SD大鼠和轉基因EGFP大鼠的股骨鉆孔模型,利用系統(tǒng)性生物力學評價手段,對兩組大鼠在不同恢復階段的骨缺損修復效果進行比較,發(fā)現(xiàn)組織結構再生與功能再生評價分別在不同層面方面反應骨損傷修復的效果,真實反映出大鼠股骨孔性缺損在修復過程中組織再生和力學再生的特點,并且觀察到生物力學功能評價能夠較組織結構評價更敏感的發(fā)現(xiàn)兩組對照組之間差異,豐富了對骨損傷修復評價的基礎研究。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R68
【圖文】：

[28]。體內不同組織的不同細胞具有分圖1 圖中顯示外泌體的形成是由內泌體融合形成MVB，成熟之后與細胞膜融合，將外泌體釋放到細胞外，從而作用與靶細胞產生信號傳遞的作用

我們采用了 BMSCs 和 RAOEC兩種細胞形成的間接共培養(yǎng)體系（圖2），上層 A 接種 BMSCs，下層 B 接種RAOEC 。 圖 示 的 半 透 膜 的 孔 徑 為0.4μm，細胞不能透過此半透膜，粒徑在 0.4μm 以下的蛋白質等小分子物質可以自由穿過，在膜的上下兩層中氧氣、CO2和營養(yǎng)物質等可以自由交換。1) 細胞準備：濃度為 2×103/ml 的 P3 代 BMSCs，濃度為 1.5×103/ml 的 P5 代 RAOEC2) 實驗分組：分為兩組，分別為共培養(yǎng)實驗組（Co-culture group）和單獨培養(yǎng)對照組（Control group）。其中共培養(yǎng)實驗組的小室內接種 BMSCs，六孔板內接種RAOEC

基質膠管腔形成實驗：a) 將購得的基質膠（Matrigel）放在冰水浴中過夜融化；b) 實驗所用的槍頭、EP 管、96 孔板在實驗前半小時置于-20℃預冷c) 取融化的基質膠（Matrigel）加入到 96 孔板，在設計好的孔里每孔加量不要有氣泡，注意此步驟在冰上操作；d) 培養(yǎng)箱放置 30min，使基質膠（Matrigel）凝固；e) 收集兩組經過 7 天培養(yǎng)后的 RAOEC，重懸并進行定量，細胞2.5×105/ml；f) 取上述定量后的細胞，每孔加 100μl 細胞懸液；g) 放置于培養(yǎng)箱中孵育 6h，在倒置顯微鏡下觀察并記錄拍照。注意：避免細胞濃度過大或過小，使成血管效果不明顯；注意基質膠的特種細胞前，所有步驟都在冰上進行。) 體內基質膠塞實驗（In vivo Materigel Plug Angiogenesis Assay）：

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本文編號：2802054