【摘要】：第一部分關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射二型膠原酶誘導(dǎo)大鼠腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)退變的實(shí)驗(yàn)研究目的:本研究擬使用二型膠原酶誘導(dǎo)大鼠腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Facet Joint Osteoarthritis,FJ OA),為藥物干預(yù)FJ OA建立動(dòng)物模型。并通過(guò)組織學(xué)和micro-CT的方法檢測(cè)該模型FJ軟骨和軟骨下骨的改變。方法:將20只三月齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為Sham組和CI組(每組10只),分別行假手術(shù)和腰椎FJ關(guān)節(jié)腔內(nèi)二型膠原酶注射手術(shù)。所有大鼠術(shù)后8周進(jìn)行安樂(lè)死,使用甲苯胺藍(lán)染色觀察FJ軟骨的組織學(xué)改變并進(jìn)行評(píng)分。使用HE染色觀察軟骨下骨的組織學(xué)改變。使用micro-CT對(duì)軟骨下骨的微結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果:甲苯胺藍(lán)染色觀察顯示,Sham組大鼠FJ軟骨表面光滑、規(guī)則,無(wú)裂縫及磨損;軟骨細(xì)胞形態(tài)正常,無(wú)數(shù)量減少;軟骨細(xì)胞外基質(zhì)染色均勻,無(wú)染色丟失。CI組大鼠關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)了明顯的退變。關(guān)節(jié)表面出現(xiàn)裂縫,部分裂縫深達(dá)中層軟骨。局部軟骨細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)了明顯的減少。CI組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)評(píng)分顯著高于Sham組大鼠(P0.001)。HE染色觀察顯示,Sham組軟骨下骨結(jié)構(gòu)正常,骨小梁排列有序。CI組軟骨下骨出現(xiàn)病變,局部出現(xiàn)明顯的纖維樣組織增生(囊腫)。Micro-CT分析結(jié)果顯示,Sham組大鼠的右上關(guān)節(jié)突形態(tài)正常,呈細(xì)長(zhǎng)形。而CI組大鼠的右上關(guān)節(jié)突形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,呈肥大狀;與Sham組相比,CI組的BMD、BV/TV和Tb.Th顯著降低(均為P0.001),但Tb.Sp和SMI顯著增加(P=0.003和P0.001)。兩組間的Tb.N值無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.177)。第二部分鮭魚(yú)降鈣素對(duì)二型膠原酶誘導(dǎo)的大鼠腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)軟骨退變的作用研究目的:本研究擬對(duì)二型膠原酶誘導(dǎo)的腰椎FJ OA大鼠模型進(jìn)行鮭魚(yú)降鈣素(Salmon Calcitonin,sCT)和塞來(lái)昔布(celecoxib,CLX)干預(yù),研究?jī)煞N藥物對(duì)大鼠FJ OA關(guān)節(jié)軟骨的作用。方法:將40只三月齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為Sham組、CI組、CLX組和sCT組(每組各10只),Sham組大鼠行假手術(shù);CI組、CLX組和s CT組大鼠行腰椎FJ關(guān)節(jié)腔內(nèi)二型膠原酶注射手術(shù)。術(shù)后CI組大鼠進(jìn)行皮下注射生理鹽水治療。CLX組大鼠經(jīng)灌胃給予CLX治療,劑量為50 mg/kg,每天一次。sCT組給予皮下注射sCT治療,劑量為16 IU/kg,兩天一次。治療8周后對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂(lè)死。使用甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)FJ軟骨退變情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。使用免疫組織化學(xué)染色對(duì)FJ軟骨中caspase-3、ADAMTS-4、Col-II、MMP-13和AGG的表達(dá)情況進(jìn)行分析。使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)對(duì)血清中COMP和MMP-13濃度進(jìn)行分析。使用相關(guān)分析的方法對(duì)血清COMP濃度與改良Mankin評(píng)分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果:甲苯胺藍(lán)染色顯示,Sham組大鼠FJ軟骨表面光滑、規(guī)則。軟骨細(xì)胞形態(tài)正常,軟骨細(xì)胞外基質(zhì)染色均勻。CI組大鼠關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)了明顯的退變。關(guān)節(jié)表面出現(xiàn)裂縫,部分裂縫深達(dá)中層軟骨,局部軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少,軟骨細(xì)胞外基質(zhì)染色不均勻。經(jīng)CLX治療后,CLX組大鼠軟骨退變情況得到了一定程度的緩解,但仍有較為明顯的軟骨表面損傷及局部染色丟失。sCT組大鼠軟骨表面的裂縫明顯減少,軟骨細(xì)胞數(shù)量正常,細(xì)胞外基質(zhì)染色較為均勻,軟骨退變得到了顯著的緩解。CI組大鼠的組織學(xué)評(píng)分顯著高于Sham組大鼠(P0.001),sCT組大鼠組織學(xué)評(píng)分顯著低于CI組(P=0.034)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:CI組caspase-3的表達(dá)水平顯著高于Sham組(P0.001),sCT組和CLX組caspase-3的表達(dá)水平均顯著低于CI組(P0.001和P=0.010)。此外,s CT組caspase-3的表達(dá)水平顯著低于CLX組(P0.001)。CI組AGG的表達(dá)水平顯著低于Sham組(P0.001)。sCT組AGG的表達(dá)水平顯著高于CI組和CLX組(P0.001和P=0.021),CLX組與CI組的AGG表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.097)。CI組ADAMTS-4的表達(dá)水平顯著高于Sham組(P0.001)。sCT組ADAMTS-4的表達(dá)水平顯著低于CI組和CLX組(P0.001和P=0.001)。CLX組與CI組的ADAMTS-4表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.103)。各組Col-II和MMP-13的表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.489和P=0.753)。ELISA結(jié)果顯示CI組血清COMP的濃度顯著高于Sham組和sCT組(P=0.010和P=0.031),但CLX組COMP的濃度與CI組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.282)。各組血清MMP-13的濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.055)。血清COMP濃度與改良Mankin評(píng)分之間具有顯著的正相關(guān)性(r=0.444,P=0.004)。第三部分鮭魚(yú)降鈣素對(duì)二型膠原酶誘導(dǎo)的大鼠腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)軟骨下骨退變及相關(guān)疼痛的作用研究目的:本研究擬對(duì)二型膠原酶誘導(dǎo)的腰椎FJ OA大鼠模型進(jìn)行s CT和CLX干預(yù),研究?jī)煞N藥物對(duì)FJ OA大鼠軟骨下骨退變及相關(guān)疼痛的作用。方法:將40只三月齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為Sham組、CI組、CLX組和s CT組(每組各10只),Sham組大鼠行假手術(shù);CI組、CLX組和sCT組大鼠行腰椎FJ關(guān)節(jié)腔內(nèi)二型膠原酶注射手術(shù)。術(shù)后CI組大鼠進(jìn)行皮下注射生理鹽水治療。CLX組大鼠經(jīng)灌胃給予CLX治療,劑量為50 mg/kg,每天一次。sCT組給予進(jìn)行皮下注射sCT治療,劑量為16 IU/kg,兩天一次。治療8周后對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂(lè)死。在術(shù)前(第0天)和手術(shù)后第3、7、14、28、42和56天使用von Frey纖維絲對(duì)大鼠進(jìn)行疼痛測(cè)試。所有動(dòng)物安樂(lè)死后使用micro-CT對(duì)軟骨下骨的微結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析,并根據(jù)L4-L5FJ的micro-CT圖片對(duì)FJ關(guān)節(jié)間隙、上關(guān)節(jié)突的長(zhǎng)度(L)、高度(H)和L/H比值進(jìn)行測(cè)量并進(jìn)行micro-CT評(píng)分。使用相關(guān)分析的方法對(duì)micro-CT評(píng)分與改良Mankin評(píng)分之間,以及血清COMP濃度與micro-CT評(píng)分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果:在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,Sham組大鼠未出現(xiàn)觸覺(jué)異常性疼痛。術(shù)前(0天)其他三組大鼠也未出現(xiàn)觸覺(jué)異常性疼痛。術(shù)后3天,該三組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的觸覺(jué)異常性疼痛;CLX組的50%PWT顯著高于CI組(P0.001),但與sCT組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P=0.146);sCT組與CI組之間也無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P=0.122)。在術(shù)后第7天,CLX組和s CT組的50%PWT均顯著高于CI組(P=0.004和P=0.041);但sCT組與CLX組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)。在術(shù)后第14天,CLX組和sCT組的50%PWT顯著高于CI組(P=0.021和P=0.002);但s CT組與CLX組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000)。在術(shù)后第28天,sCT組的50%PWT顯著高于CI組(P=0.002);CLX組與CI組及sCT組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.295和P=0.213)。在術(shù)后第42天和第56天,sCT組的50%PWT均顯著高于CI組和CLX組(P=0.043和P=0.025;P0.001和P=0.020);但CLX組與CI組對(duì)比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.000和P=0.625)。與Sham組相比,CI組的BMD、BV/TV和Tb.Th值顯著降低(均為P0.001),但Tb.Sp和SMI顯著增加(P=0.002和P=0.013)。與CI組相比,sCT組的BMD、BV/TV和Tb.Th值顯著增高(P=0.003、P=0.001和P=0.040),而Tb.Sp和SMI值顯著降低(P=0.019和P=0.031)。此外,與CLX組相比,s CT組的BMD和BV/TV值顯著增高(P=0.016和P=0.004),而Tb.Th、Tb.Sp和SMI值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.175,P=0.074和P=0.054)。CI組與CLX組的BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp和SMI值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.541,P=0.515、P=0.459、P=0.545和P=0.803)。各組間的Tb.N值無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.096)。Sham組右上關(guān)節(jié)突的長(zhǎng)度明顯大于其高度,呈細(xì)長(zhǎng)形。而CI組的右上關(guān)節(jié)突呈肥大狀,高度顯著增加。與Sham組相比,CI組關(guān)節(jié)突的長(zhǎng)度下降了13.81%,L/H比值減少58.87%,但高度增加113.38%(均為P0.001)。與CI組和CLX組相比,s CT組的L/H比值分別增加60.42%和23.63%(P0.001和P=0.005),但高度分別減少34.14%和15.07%(P=0.001和P=0.098)。與CI組相比,CLX組的L/H比值增加了29.76%,但高度減少了22.45%(P=0.006和P=0.023)。各組間關(guān)節(jié)間隙寬度無(wú)顯著差異(P=0.376)。CI組的micro-CT評(píng)分顯著高于Sham組和sCT組(P0.001和P=0.002)。但CLX組與sCT組之間,及CLX組與CI組之間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.685和P=0.230)。Micro-CT評(píng)分與改良Mankin評(píng)分(r=0.807,P0.001)以及血清COMP濃度和micro-CT評(píng)分(r=0.370,P=0.019)之間均具有顯著的正相關(guān)性。第四部分鮭魚(yú)降鈣素對(duì)去勢(shì)大鼠腰椎關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)軟骨退變的作用研究目的:本研究擬使用去勢(shì)(Ovariectomy,OVX)大鼠模型探討雌激素缺乏誘導(dǎo)FJ軟骨退變的特點(diǎn)及機(jī)制,以及sCT對(duì)FJ軟骨退變的干預(yù)效果。方法:將30只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為Sham組、OVX組和OVX+sCT組(每組各10只)。Sham組大鼠行假手術(shù);OVX組和OVX+sCT組大鼠行去勢(shì)手術(shù)。術(shù)后OVX組大鼠進(jìn)行皮下注射生理鹽水治療。OVX+sCT組給予皮下注射sCT治療,劑量為16IU/kg,兩天一次。治療12周后對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂(lè)死。使用甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)FJ軟骨退變情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分及軟骨厚度測(cè)量。使用免疫組織化學(xué)染色對(duì)FJ軟骨中caspase-3、Col-II和MMP-13的表達(dá)情況進(jìn)行分析。使用ELISA法對(duì)血清中COMP濃度進(jìn)行分析。使用相關(guān)分析的方法對(duì)血清COMP濃度與改良Mankin評(píng)分,以及血清COMP濃度與軟骨厚度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果:OVX組大鼠血清COMP濃度顯著高于Sham組(P0.001)。經(jīng)sCT治療后,OVX+sCT組大鼠的血清COMP濃度顯著低于OVX組(P=0.028)。Sham組和OVX+sCT組的血清COMP濃度無(wú)顯著差異(P0.05)。甲苯胺藍(lán)染色觀察顯示,Sham組FJ的軟骨表面完整、光滑,軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞外基質(zhì)甲苯胺藍(lán)染色呈均勻分布。OVX組大鼠出現(xiàn)明顯的軟骨退變,表現(xiàn)為軟骨表面不規(guī)則及出現(xiàn)小裂縫。經(jīng)sCT治療后,OVX+sCT大鼠的軟骨損傷在一定程度上得到緩解。OVX組大鼠關(guān)節(jié)的改良Mankin評(píng)分顯著高于Sham組(P=0.015)。OVX組與OVX+sCT組之間,以及Sham組與OVX+sCT組之間的改良Mankin評(píng)分沒(méi)有顯著差異(均P0.05)。OVX組大鼠的軟骨厚度與Sham組相比顯著降低(P0.001)。OVX+sCT組的軟骨厚度顯著高于OVX組(P=0.024),但顯著低于Sham組(P=0.007)。與Sham組相比,OVX組大鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP-13和caspase-3表達(dá)水平顯著增高(均為P0.001)。與OVX組相比,OVX+sCT組大鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP-13和caspase-3表達(dá)水平顯著降低(均為P0.001)。與Sham組相比,OVX+sCT組的MMP-13和caspase-3的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(均為P0.05)。各組間Col-II的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。血清COMP濃度與改良Mankin評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.467,P0.05),但與軟骨厚度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.485,P0.05)。結(jié)論:1.FJ關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射二型膠原酶可導(dǎo)致SD大鼠關(guān)節(jié)突呈肥大性改變,關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)明顯的損傷,軟骨下骨出現(xiàn)纖維樣組織增生(囊腫)及微結(jié)構(gòu)退變。2.CLX與sCT對(duì)二型膠原酶誘導(dǎo)的SD大鼠FJ OA軟骨均具有一定的保護(hù)作用,但sCT對(duì)軟骨的保護(hù)作用更為顯著。其作用機(jī)制可能與sCT維持軟骨代謝平衡及抑制軟骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。此外,血清COMP可能具有預(yù)測(cè)FJ OA的潛力。3.FJ關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射二型膠原酶可導(dǎo)致SD大鼠出現(xiàn)顯著的觸覺(jué)異常性疼痛、關(guān)節(jié)突肥大、micro-CT評(píng)分增高以及軟骨下骨退變。sCT與CLX均具有一定的鎮(zhèn)痛作用,但sCT的長(zhǎng)期鎮(zhèn)痛效果更顯著。此外,sCT還可以顯著地降低micro-CT評(píng)分,并抑制軟骨下骨退變及關(guān)節(jié)肥大。4.SD大鼠去勢(shì)術(shù)后12周,雌激素缺乏可以導(dǎo)致FJ軟骨出現(xiàn)明顯的退變,尤其是軟骨厚度顯著下降。sCT干預(yù)可以抑制增強(qiáng)的軟骨分解代謝活動(dòng)以及血清中COMP水平的升高,對(duì)FJ軟骨具有積極的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R684
【圖文】：

30圖 2 各組動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)表現(xiàn)（甲苯胺藍(lán)染色）Fig.2 Histological appearance of articular cartilage between groups(toluidine blue staining)Note: A: Sham group; B: CI group. "→" represents fissures of articularcartilage. Bar = 100μm.

各組動(dòng)物體重變化

改良Mankin組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

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