【摘要】：研究背景冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病,coronary heart disease,CHD)是嚴(yán)重威脅人類健康、減低人類壽命的疾病之一,它是最常見的后天性心臟病。20世紀(jì)60年代出現(xiàn)的冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(冠脈搭橋,coronary artery bypass graft,CABG),是現(xiàn)今治療冠心病最安全、有效的手術(shù)方法之一。目前CABG使用最普遍的靜脈移植橋血管仍然是自體大隱靜脈(human saphenous vein,HSV),采用冠狀動(dòng)脈狹窄遠(yuǎn)端-HSV-升主動(dòng)脈吻合的方法是CABG的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方式之一。相關(guān)研究表明,約有15%的移植HSV將在CABG術(shù)后1年內(nèi)閉塞,而移植HSV 10年通暢率低于50%-60%。自體HSV橋血管的高堵塞率成為限制CABG手術(shù)效果的嚴(yán)重障礙,如何降低HSV橋血管的堵塞發(fā)生率已經(jīng)成為CABG術(shù)后一個(gè)亟待解決的問題。移植靜脈再狹窄是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,其基本病理改變是移植靜脈橋血管內(nèi)膜增生,主要病理生理機(jī)制是以移植靜脈橋血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)損傷為觸發(fā)環(huán)節(jié),導(dǎo)致內(nèi)皮下炎癥浸潤(rùn),血管平滑肌(vein smooth muscle cell,SMC)過度增生、異常遷移導(dǎo)致內(nèi)膜增生,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量分泌沉積進(jìn)一步致移植靜脈內(nèi)膜增厚、硬化和狹窄,最終導(dǎo)致移植靜脈閉塞。眾多研究顯示,通過促進(jìn)損傷移植血管內(nèi)皮細(xì)胞功能恢復(fù),能夠加速血管再內(nèi)皮化,從而達(dá)到減輕移植靜脈內(nèi)膜增生、改善移植靜脈遠(yuǎn)期通暢率、提高CABG的手術(shù)效果的目的。MicroRNAs(miRNAs,miRs)是一類短鏈非編碼小RNA,它通過與mRNA堿基配對(duì)結(jié)合使其降解或者沉默來抑制蛋白質(zhì)翻譯過程,從而發(fā)揮調(diào)控各種特異性靶基因的表達(dá)的效應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮特異性miR-126-3p,在血管完整性的維持、血管生成、胚胎血管發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用。miR-126-3p基因敲除小鼠可出現(xiàn)血管破裂、出血,部分胚胎致死。已有研究結(jié)果證明,在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中,SPRED-1(sprouty-related EVHl domain-containing protein 1)和 PIK3R2(phosphoinositol-3 kinaseregulatory subunit 2)是 miR-126-3p 的潛在靶基因,同時(shí)SPRED-1 和 PIK3R2 基因是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)上游的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,而VEGF能夠通過增強(qiáng)PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)EC細(xì)胞的增殖功能、遷移功能和成管能力等。一項(xiàng)體外研究證明內(nèi)皮微泡(EMPs)介導(dǎo)的miR-126-3p傳遞能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移,相關(guān)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-126-3p EMPs能夠促進(jìn)損傷動(dòng)脈血管的再內(nèi)皮化。多個(gè)有關(guān)循環(huán)miR-126-3p臨床研究發(fā)現(xiàn),血液中miR-126-3p的表達(dá)與某些心血管疾病密切相關(guān)。穩(wěn)定性心絞痛CAD患者血清miR-126-3p表達(dá)量較正常人降低,miR-126-3p表達(dá)量與致死心肌梗死發(fā)生呈正相關(guān);2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者血漿miR-126-3p表達(dá)下降與DM患者血管并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)。目前,miR-126-3p在移植靜脈血管橋衰敗中的角色尚不清楚,miR-126-3p對(duì)移植橋血管內(nèi)膜增生和再內(nèi)皮化的研究尚未見報(bào)道。研究探討miR-126-3p在移植靜脈血管病變中的作用有著巨大理論的意義和廣闊的臨床的應(yīng)用前景,并可能掀起CABG手術(shù)后防治移植橋血管衰敗的治療策略的巨大變革。本研究可分為四部分。第一部分循環(huán)m i R-126-3p在CABG患者手術(shù)前后表達(dá)變化及機(jī)制的臨床研究目的檢測(cè)CABG患者(嚴(yán)重冠心病需行CABG者)手術(shù)前后循環(huán)miR-126-3p表達(dá)水平變化以及與健康志愿者差異,檢測(cè)離體培養(yǎng)的大隱靜脈血管miR-126-3p表達(dá)動(dòng)態(tài)變化,分析可能機(jī)制,為miR-126-3p參與CABG患者移植血管病變保護(hù)提供臨床線索。方法收集健康志愿者與CABG患者術(shù)前血液標(biāo)本,行RT-PCR檢測(cè)血漿miR-126-3p的表達(dá)差異,比較健康志愿者與冠心病人在CABG術(shù)前的循環(huán)miR-126-3p表達(dá)差異。同時(shí),收集冠心病患者行CABG術(shù)后1、3、7,14天血液標(biāo)本,RT-PCR檢測(cè)CABG患者手術(shù)前后miR-126-3p的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。收集CABG患者術(shù)后剩余大隱靜脈片段,對(duì)其行離體血管培養(yǎng)0,7,14天,行RT-PCR檢測(cè)離體培養(yǎng)血管組織miR-126-3p動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示:CABG患者術(shù)前miR-126-3p表達(dá)量較正常人明顯降低(P0.05)。CABG患者手術(shù)后miR-126-3p呈一過性升高,術(shù)后3天表達(dá)量最高,但與健康志愿者相比表達(dá)量仍明顯降低。CABG患者術(shù)后7-14天左右miR-126-3p表達(dá)量逐漸恢復(fù)至術(shù)前水平。大隱靜脈離體培養(yǎng)模型構(gòu)建成功,RT-PCR結(jié)果顯示,離體血管miR-126-3p表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化,培養(yǎng)7天左右miR-126-3p表達(dá)量升高,培養(yǎng)14天左右時(shí)miR-126-3p表達(dá)量逐漸降低至未培養(yǎng)水平。結(jié)論嚴(yán)重冠心病患者血管病變可能與miR-126-3p表達(dá)量降低有關(guān);冠心病患者CABG術(shù)后miR-126-3p的表達(dá)量升高可能與機(jī)體的代償性作用有關(guān);但這種代償性升高是不完全的。提高miR-126-3p表達(dá)水平可能對(duì)移植橋血管有益,這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。第二部分m i R-126-3p對(duì)大隱靜脈細(xì)胞增殖和遷移功能的影響及相關(guān)機(jī)制的體外研究目的探討 miR-126-3p 對(duì)大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human saphenous vein endothelial cells,HSVECs)增殖和遷移功能的影響,并探討可能機(jī)制及相關(guān)通路。平滑肌細(xì)胞的增生紊亂并遷移至內(nèi)膜層以及ECM的沉積導(dǎo)致內(nèi)膜增生。探討miR-126-3p的表達(dá)變化對(duì)大隱靜脈平滑肌細(xì)胞(human saphenous vein smooth muscle cells,HSVSMCs)的增生和遷移影響,為下一步應(yīng)用研究做鋪墊。方法1.收集CABG術(shù)后剩余大隱靜脈片段,HSVECs的分離培養(yǎng)采用膠原酶消化法,并應(yīng)用VWF免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。HSVSMCs的分離培養(yǎng)采用組織塊法,并應(yīng)用α-SMA細(xì)免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。2.我們分別采用了 EdU實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)miR-126-3p對(duì)HSVECs增殖和遷移能力的影響。RT-PCR和westemblot檢測(cè)miR-126-3p的潛在靶基因SPRED-1和PIK3R2的mRNA和蛋白表達(dá)變化。同時(shí)采用western blot方法檢測(cè)VEGF相關(guān)通路p-ERK、ERK、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá)變化。3.EdU實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn),評(píng)估不同濃度的(25-200nmol)miR-126-3p對(duì)HSVSMCs增殖和遷移的影響。另外,我們構(gòu)建了 HSVSMCs的炎癥模型,進(jìn)一步評(píng)價(jià)了 miR-126-3p在炎癥條件(TNF-α)下對(duì)HSVSMCs增殖和遷移功能的影響。結(jié)果1.成功分離并鑒定了原代HSVECs和HSVSMCs。內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí),100nmolmiR-126-3pagomir可達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率。EdU實(shí)驗(yàn)證實(shí),上調(diào)或下調(diào)miR-126-3p表達(dá)能夠增強(qiáng)或抑制HSVECs增殖。同時(shí),劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)或下調(diào)mi-126-3p表達(dá)可以增強(qiáng)或抑制HSVECs遷移。2.PT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)或下調(diào)miR-126-3p表達(dá)可使miR-126-3p的潛在靶基因SPRED-1和PIK3R2 mRNA表達(dá)降低或者升高,western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)上調(diào)或下調(diào)miR-126-3p表達(dá)可使SPRED-1和PIK3R蛋白表達(dá)量降低或者升高。同時(shí)western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)或下調(diào)miR-126-3p表達(dá),可分別使PI3K/AKT信號(hào)通路和MAPK/ERK1/2信號(hào)通路磷酸化程度增強(qiáng)或者抑制。3.EdU實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell證實(shí)不同濃度的(25-200 nmol)miR-126-3p agomir對(duì)HSVSMCs增殖和遷移均沒有影響。此外,在TNF-α炎癥因子刺激下,不同濃度的(25-200 nmol)miR-126-3p agomir對(duì)HSVSMCs增殖和遷移也沒有影響。結(jié)論1.miR-126-3p通過下調(diào)其靶基因SPRED-1和PIK3R2的表達(dá),經(jīng)ERK和AKT信號(hào)通路促進(jìn)HSVECs增殖和遷移。2.miR-126-3p對(duì)HSVSMCs增殖和遷移功能沒有影響。第三部分過表達(dá)m i R-126-3p對(duì)離體培養(yǎng)的大隱靜脈血管內(nèi)膜增生和再內(nèi)皮化的離體研究目的探討過表達(dá)miR-126-3p對(duì)離體培養(yǎng)的大隱靜脈內(nèi)膜增生和再內(nèi)皮化的影響,為miR-126-3p參與移植血管保護(hù)提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)支持,并為下一步miR-126-3p agomir體內(nèi)應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法收集CABG患者術(shù)后殘余大隱靜脈片段,建立大隱靜脈離體培養(yǎng)模型。分為四組:未培養(yǎng)組、對(duì)照組(離體培養(yǎng)14天)、NC agomir組(離體培養(yǎng)14天+miR-126-3p negtive control agomir)、miR-126-3p agomir 組(離體培養(yǎng)14天+miR-126-3p agomir)。收集不同組標(biāo)本,行HE染色評(píng)估大隱靜脈血管內(nèi)膜增生狀況;行血管內(nèi)皮層CD31免疫組化染色,評(píng)價(jià)大隱靜脈血管再內(nèi)皮化情況。結(jié)果1.給予離體培養(yǎng)的大隱靜脈miR-126-3p agomir能夠減輕大隱靜脈血管內(nèi)膜增生;2.給予離體培養(yǎng)的大隱靜脈miR-126-3p agomir促進(jìn)大隱靜脈血管再內(nèi)皮化。結(jié)論通過miR-126-3p agomir過表達(dá)miR-126-3p能夠促進(jìn)離體大隱靜脈內(nèi)皮化,減輕血管內(nèi)膜增生,這為miR-126-3p下一步的活體應(yīng)用研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第四部分過表達(dá)miR-126-3p對(duì)移植靜脈橋血管再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生的體內(nèi)研究目的探討局部應(yīng)用miR-126-3p agomir對(duì)大鼠移植橋血管再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生的影響。方法構(gòu)建自體靜脈移植大鼠動(dòng)物模型,局部轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的miR-126-3p agomir,熒光成像和western blot評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)組分成四組,正常對(duì)照組,血管移植組,NCagomir組、miR-126-3pagomir組。血管移植術(shù)后28天,行血管彩超評(píng)價(jià)移植靜脈內(nèi)徑和血流動(dòng)力學(xué)改變。HE染色評(píng)價(jià)內(nèi)膜增生,Masson染色評(píng)價(jià)膠原蛋白沉積,PCNA免疫組化、α-SMA免疫組化染色評(píng)價(jià)VSMC增生情況。Evans染色、CD31免疫熒光評(píng)價(jià)移植血管再內(nèi)皮情況,CD68免疫組化評(píng)價(jià)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)情況。結(jié)果1.成功構(gòu)建大鼠靜脈移植模型,免疫熒光和western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)局部轉(zhuǎn)染miR-126-3p agomir 效果好。2.大鼠血管彩超檢查提示:局部轉(zhuǎn)染miR-126-3p agomir能夠減輕大鼠靜脈移植血管狹窄,改善移植血管血流動(dòng)力學(xué)。3.HE評(píng)價(jià)內(nèi)膜增生染色證實(shí)局部給予miR-126-3p agomir與血管移植組,NC agomir組相比明顯降低內(nèi)膜增厚。Masson染色結(jié)果提示局部給予miR-126-3p agomir對(duì)膠原蛋白沉積無影響。PCNA免疫組化和α-SMA免疫組化結(jié)果表明局部給予miR-126-3p agomir可明顯改善移植血管內(nèi)膜平滑肌增生和遷移程度。4.Evans染色、CD31免疫熒光結(jié)果表明局部給予miR-126-3p agomir可促進(jìn)移植血管再內(nèi)皮化,CD68免疫組化表明,局部給予miR-126-3p agomir可減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論1.局部過表達(dá)miR-126-3p能夠降低移植血管狹窄,改善血流動(dòng)力學(xué),其主要機(jī)制是miR-126-3p能夠促進(jìn)移植血管再內(nèi)皮化,減輕炎癥反應(yīng),從而抑制內(nèi)皮下VSMC過度增生和異常遷移,減輕移植血管內(nèi)膜增生。2.miR-126-3p agomir局部轉(zhuǎn)染的方法為移植血管再狹窄的防治提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R654.2
【圖文】：

邐３邋（３０％）邐１邋（１０％）邐Ｐ＝０．２８７８逡逑圖１逡逑Ａ邐Ｂ逡逑ｐｉ邋，邐，邐｜５２＇５］邐＿邐＾逡逑Ｊｉ３＇邐Ｉｆ邋ｉ邋ｉ邋Ｔ逡逑屸ＩＩ邐Ｉ娭邐椨W 曬＿逡逑Ｃ邋，邐，邐Ｄ逡逑ＺＯ－．邋＿＿＿＿＿＿逡逑８》ｉ邋丁邐ｉ＿Ｊ邋？逡逑ＩＩ－邐Ｋ１＇５＇邋＿邋烺墨逡逑Ｐ：Ｌ邐［Ｍ邐ｒｌｌ邐ｌ邐１１逡逑，／邋／／／逡逑圖１．邋ｍｉＲ－１２６－３ｐ在ＣＡＢＧ患者和正常人血漿以及在離體培養(yǎng)的大隱靜脈中逡逑的相對(duì)表達(dá)量。（Ａ）正常人與嚴(yán)重冠心病人循環(huán)ｍｉＲ－１２６－３ｐ的比較。（Ｂ）ＣＡＢＧ逡逑７６逡逑

ｍｉＲ－１２６－３ｐ表達(dá)峰值與正常人比較。（Ｄ）離體培養(yǎng)的大隱靜脈模型組織逡逑ｍｉＲ－１２６－３ｐ邋表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化。＊Ｐ＜０．５，邋＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１（下同）。逡逑圖２逡逑Ｄ邐Ｅ邐Ｆ邐逡逑■Ｈ逡逑圖２．原代ＨＳＶＥＣｓ的提取與鑒定的典型圖片。（Ａ）膠原酶消化法提取原代逡逑ＨＳＶＥＣｓ（Ｂ）原代ＨＳＶＥＣｓ培養(yǎng)１０天后可完全長(zhǎng)滿，呈橢圓形、梭形，大小不逡逑均一。（Ｃ）邋ＨＳＶＥＣｓ傳代３次細(xì)胞ＨＳＶＥＣｓ呈典型的鋪路石狀生長(zhǎng)。（Ｄ）邋ＶＷＦ逡逑細(xì)胞免疫熒光染色。（Ｅ）ＤＡＰＩ標(biāo)記細(xì)胞核。（Ｆ）細(xì)胞免疫染色可見所提取細(xì)胞１００％逡逑表達(dá)ＶＷＦ。逡逑７７逡逑

逡逑圖３逡逑ｆｍｍ逡逑＿＿＿逡逑圖３．原代ＨＳＶＳＭＣｓ的提取與鑒定的典型圖片。（Ａ）組織塊培養(yǎng)法提取原代逡逑ＨＳＶＳＭＣｓ邋（Ｂ）原代ＨＳＶＳＭＣｓ培養(yǎng)３天后可見細(xì)胞從組織塊爬出，形態(tài)多變，逡逑大小可不均一。（Ｃ）邋ＨＳＶＳＭＣｓ培養(yǎng)傳代３次后呈平滑肌細(xì)胞典型的波峰、波谷逡逑樣生長(zhǎng)。（Ｄ）ｃｘ－ＳＭＡ細(xì)胞免疫熒光染色。（Ｅ）ＤＡＰＩ標(biāo)記細(xì)胞核。（Ｆ）細(xì)胞免疫染逡逑色可見所提取細(xì)胞１００％表達(dá)ａ－ＳＭＡ。逡逑圖４逡逑Ａ邋２５ｎｍｏｌ邋Ｂ邋５０ｎｍｏｌ邋Ｃ邋１００ｎｍｏｌ邋Ｄ２００ｎｍｏｌ逡逑■■■■逡逑ｍｕｕｕ逡逑ｍｕｕｕ逡逑圖四．不同濃度的Ｃｙ３標(biāo)記ｍｉＲ－１２６－３ｐ邋ａｇｏｍｉｒ轉(zhuǎn)染原代ＨＳＶＥＣｓ的滅光成像。逡逑７８逡逑

本文編號(hào)：2798662