【摘要】：目的:研究晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)對(duì)人軟骨細(xì)胞增殖及自噬活性的影響,并初步探討其可能機(jī)制。方法:(1)不同濃度AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)分別處理人軟骨細(xì)胞6h,12h,24h,48h,72h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。(2)不同濃度AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)分別處理人軟骨細(xì)胞6h,12h,24h,48h,72h后采用WesternBlot方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)。(3)不同濃度的AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)處理人軟骨細(xì)胞24h后,WesternBlot方法檢測(cè)細(xì)胞Beclin1、LC3 Ⅱ、P62蛋白的表達(dá),電子透射顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)目,自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)融合蛋白標(biāo)記觀察細(xì)胞內(nèi)mRFP-GFP-LC3數(shù)目。(4)不同濃度的AGEs(50mg/l,100mg/l,200mg/l)處理人軟骨細(xì)胞24h后,WesternBlot方法檢測(cè)細(xì)胞mTOR、p-mTOR和PPARy蛋白的表達(dá)。(5)人軟骨細(xì)胞加入PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮和PPARy抑制劑T0070907預(yù)孵2h后,再加入200mg/l的AGEs處理24h后,采用WesternBlot方法檢測(cè)細(xì)胞LC3Ⅱ、mTOR和p-mTOR蛋白的表達(dá)。結(jié)果:(1)50mg/l AGEs和100mg/l AGEs處理組在24h之內(nèi)細(xì)胞生存率明顯高于對(duì)照組,但在48h之后細(xì)胞生存率明顯低于對(duì)照組。200mg/l AGEs處理組細(xì)胞的生存率在6h之內(nèi)高于對(duì)照組,在6h之后細(xì)胞生存率低于對(duì)照組(p0.05)。50mg/l、100mg/l、200mg/lAGEs處理細(xì)胞24h后的細(xì)胞生存率分別為1.289±0.011,1.451±0.009,0.663±0.014,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)AGEs處理細(xì)胞后,WB結(jié)果顯示細(xì)胞LC3Ⅱ蛋白表達(dá)先升高后降低,50mg/l和100mg/l AGEs處理組LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)24h達(dá)到最高值,24h后LC3 Ⅱ蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降;200mg/l AGEs處理組LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)6h達(dá)到最高值,6h后LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降,12h后與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;48h后三組AGEs處理組LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)WB檢測(cè)結(jié)果顯示,50mg/l和100mg/l AGEs處理24h后細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ和Beclin1蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組,P62的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。200mg/l AGEs處理24h后細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ和Beclin1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,而P62的表達(dá)高于對(duì)照組。透射電子顯微鏡技術(shù)(TEM)及mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,50mg/l和100mg/l AGEs處理24h后人軟骨細(xì)胞內(nèi)的自噬小體數(shù)目及GFP-LC3數(shù)目明顯高于對(duì)照組。200mg/l AGEs處理24h后細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)目及mRFP-GFP-LC3數(shù)目明顯低于對(duì)照組。(4)AGEs處理人軟骨細(xì)胞24h后PPAR γ的表達(dá)明顯低于對(duì)照組,且隨AGEs濃度的增加PPARγ的表達(dá)明顯降低。50mg/l和100mg/l AGEs處理人軟骨細(xì)胞24h后p-mTOR的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。200mg/l AGEs處理人軟骨細(xì)胞24h后p-mTOR的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。(5)吡格列酮+AGEs 200mg/l組中軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)明顯高于200mg/l AGEs 組,p-mTOR 表達(dá)明顯低于 200mg/l AGEs 組。T0070907+ AGEs 200mg/L組中軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)明顯低于200mg/l AGEs處理組,p-mTOR表達(dá)明顯高于200mg/l AGEs組。結(jié)論:1.AGEs可以影響人軟骨細(xì)胞的增殖活性和自噬活性,低、中濃度和短時(shí)間刺激可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和自噬活性,高濃度和長(zhǎng)時(shí)間刺激則呈抑制作用。2.AGEs可以通過(guò)PPARγ調(diào)控mTOR通路影響人軟骨細(xì)胞的自噬活性。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R684.3
【圖文】：

生存率低于對(duì)照組（ｐ＜０．００１）。在２４小時(shí)時(shí)三組ＡＧＥｓ處理組細(xì)胞生存率分別逡逑為１．２８９±０．０１１，１．４５１±０．００９，邋０．６６３±０．０１４，組間比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義逡逑（ｐ＜０．００１），如圖２所示。逡逑邐表１不同ＡＧＥｓ濃度處理軟骨細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)的ＯＤ值邐逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＡＧＥｓ（５０ｍｇ／ｌ）邋ＡＧＥｓ（１００ｍｇ／ｌ）邋ＡＧＥｓ（２００ｍｇ／ｌ）逡逑０邐０．５０６±０．００６邐０．５２３邋±０．００６邐０．５２６±０．００６邐０．５２５邋±０．００７逡逑６ｈ邐１．１８１邋±０．００６邐１．５８４１０．０３１邐１．７１６±０．０２１邐１．５０５±０．０１１逡逑１２ｈ邐２．１９８１０．０４７邐２．５４２１０．０３１邐３．１３７±０．０５９邐２．２０２±０．０４２逡逑２４ｈ邐２．３７２±０．０５７邐２．７５０±０．００９邐３．２０３±０．０７２邐２．１３３±０．０３７逡逑４８ｈ邐３．０６８±０．０９８邐２．９４８±０．０１６邐３．０８２±０．０２１邐２．１３７±０．０４７逡逑７２ｈ邐３．２７３邋±０．１４４邐２．９０４±０．００２

３．２邋ＡＧＥｓ對(duì)人軟骨細(xì)胞自噬活性的影響逡逑不同濃度的ＡＧＥｓ處理軟骨細(xì)胞不同時(shí)間后通過(guò)ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)逡逑ＬＣ３ＩＩ蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示（如圖３），５０ｍｇ／ｌ和１００ｍｇ／ｌＡＧＥｓ處理組，細(xì)胞逡逑內(nèi)ＬＣ３邋ＩＩ蛋白的表達(dá)在２４小時(shí)之內(nèi)明顯高于對(duì)照組，２４小時(shí)之后明顯下降。逡逑２００ｍｇ／ｌ邋ＡＧＥｓ處理組，在６小時(shí)之內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ＬＣ３邋ＩＩ蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，６小逡逑時(shí)之后明顯下降。逡逑ＡＧＥｓ邋（５０ｍｇ／ｌ）邐２．（Ｈ邐灥邐■邋ｃｏｎ逡逑Ａ邋邐邋Ｄ邐１￣Ｉ邋—邐■邋ａｈ逡逑ｃｏｎ邋６ｈ邋１２ｈ邐２４ｈ邐４８ｈ邐７２ｈ邐Ｉ邐１逡逑邐１邐１．Ｈ邐ＪｊＬ邋■１２ｈ逡逑ＬＣ３邋Ｉ邋－邐－邐—邋＾邐＿邋一邋臟邐■邋２４ｈ逡逑邐邋邐邋邋邋Ｓ邐１邋ｏＪ邐■邋４８ｈ逡逑ＬＣ３＂邐邋｜邐１邐ｍｍ逡逑邐Ｊ邋■邋Ｗｉ逡逑Ｂ，邐ｒ邐ＡＧＥｓ（５０ｍｇ／ｌ）逡逑邐ＡＧＥｓ邋（１ＱＱｍｇ／ｌ）邐邋ｔ邐—逡逑ｃｏｎ邋６ｈ邋１２ｈ邋２４ｈ邐４８ｈ邐７２ｈ邐２？勹邐＊卜廣丨■哪逡逑■邋６ｈ逡逑ＬＣ３邋Ｉ邋■丨＿邐—邋■邋■■邋ｍｍｍｍｍ邐■邋１２ｈ逡逑邐邐Ｉ邐■邋２４ｈ逡逑ＬＣ３ＩＩ邐－一邋—邐ｇ邋１．０－邐＾邐■邋４８ｈ逡逑■邋７２ｈ逡逑ＡＧＥｓ（１００ｍｇ／ｌ）逡逑Ｑ邐ＡＧＥｓ邋（２００ｍｇ／ｌ）邐邋Ｆ邋。灼邐■邋ｃｏｎ逡逑ｃｏｎ邐６ｈ一１２ｈ邋２４ｈ邐４８ｈ邋７２ｈ一邐？邐■邋６ｈ逡逑邐１邋0．Ｈ邋＿邐■１２ｈ逡逑ＬＣ３Ｉ邋—？邐碡料“邐Ｂ邐＾丁邐

逑根據(jù)Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ條帶灰度分析ＬＣ３邋ＩＩ／ＬＣ３邋Ｉ結(jié)果，將不同濃度處理組的逡逑ＬＣ３邋ＩＩ蛋白相對(duì)表達(dá)量與時(shí)間的變化關(guān)系繪制折線圖（如圖４）。結(jié)果顯示，逡逑ＡＧＥｓ處理細(xì)胞后ＬＣ３ＩＩ蛋白表達(dá)先升高后降低，５０ｍｇ／ｌ和１００ｍｇ／ｌＡＧＥｓ處理逡逑組ＬＣ３ＩＩ蛋白的表達(dá)２４ｈ達(dá)到最高值，２４ｈ后ＬＣ３１Ｉ蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐逡逑漸下降；２００ｍｇ／ｌＡＧＥｓ處理組ＬＣ３ＩＩ蛋白的表達(dá)６ｈ達(dá)到最高值，６ｈ后ＬＣ３ＩＩ逡逑蛋白的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，１２ｈ后與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；４８ｈ逡逑后三組ＡＧＥｓ處理組ＬＣ３邋ＩＩ蛋白的表達(dá)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑１．５－１逡逑１．邋ｃｏｎ逡逑５０ｍｇ／ｌ逡逑甲邋１０＿邐十邋１00＿逡逑§邐－ｔ／／邐２００ｍｇ／ｌ逡逑Ｉ逡逑０．０－Ｉ￣Ｉ邐１邐１邐１邐１邐１—逡逑０邐６邐１２邐２４邐４８邐７２逡逑Ｗｉ］（ｈ）逡逑圖４ＡＧＥｓ對(duì)人軟骨細(xì)胞ＬＣ３ＩＩ蛋白的表達(dá)折線圖。不同濃度處理組的ＬＣ３ＩＩ蛋白表達(dá)隨時(shí)逡逑間變化的關(guān)系。數(shù)據(jù)以Ｘ土ＳＥ邋（ｎ邋＝邋３）表示。＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ＜０．０ｌ，邋＊＊＊ｐ＜０．００ｌ，與對(duì)照組逡逑比較。逡逑分別用５０邋ｍｇ／ｌ，邋１００邋ｍｇ／ｌ和２００ｍｇ／ｌ三種不同濃度的ＡＧＥｓ處理人軟骨細(xì)胞逡逑２４小時(shí)后進(jìn)一步檢測(cè)Ｂｅｃｌｉｎｌ和Ｐ６２蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 薛慶云;王坤正;裴福興;朱漢民;金大地;陶天遵;李恩;李寧華;張耀南;王曉濱;紀(jì)泉;;中國(guó)40歲以上人群原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患病狀況調(diào)查[J];中華骨科雜志;2015年12期

2 陳鋮;馬翅;張瑩;肖鈞;蔡巍;譚海濤;;AGEs對(duì)兔軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13表達(dá)的影響及其機(jī)制研究[J];湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

本文編號(hào)：2793750