【摘要】：[研究目的]外科手術(shù)后常常繼發(fā)術(shù)后慢性疼痛,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來研究顯示,CX3CL1在神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用,然而CX3CL1是否參與術(shù)后慢性疼痛并不清楚。本研究采用大鼠皮膚肌肉切口牽拉(skin/muscle incision and retraction,SMIR)模型模擬術(shù)后慢性疼痛,探討CX3CL1是否參與SMIR誘導(dǎo)的痛覺過敏以及其機(jī)制。[研究方法]一、研究SMIR術(shù)后大鼠脊髓背角CX3CL1表達(dá)情況及CX3CL1是否參與SMIR誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏首先行SMIR術(shù)并檢測SMIR術(shù)前及術(shù)后第1、5、10、20天大鼠手術(shù)同側(cè)和對側(cè)的50%機(jī)械撤足閾值(paw withdrawal threshold,PWT);SMIR術(shù)前30min直至術(shù)后第10天每天一次或SMIR術(shù)10天后已產(chǎn)生顯著機(jī)械性痛覺過敏的情況下再連續(xù)5天每天一次鞘內(nèi)注射CX3CL1中和性抗體,分別檢測大鼠術(shù)側(cè)PWT變化;分別取空白對照組、SMIR術(shù)后第1、5、10、20天大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角,進(jìn)行westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)檢測 CX3CL1 的蛋白和 mRNA 表達(dá)水平;分別取空白對照組、單純SMIR組及SMIR+CX3CL1 antibody組大鼠脊髓,免疫熒光檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Ibal在脊髓背角的熒光信號強(qiáng)度;SMIR術(shù)后第10天取大鼠脊髓,免疫熒光檢測CX3CL1在脊髓背角的表達(dá)部位。二、檢測SMIR是否激活大鼠脊髓背角STAT3及STAT3是否介導(dǎo)了 CX3CL1的上調(diào)和痛覺過敏SMIR術(shù)后第10天取大鼠脊髓,免疫熒光檢測p-STAT3在脊髓背角的表達(dá)部位以及CX3CL1和p-STAT3是否存在共定位;分別取空白對照組、SMIR術(shù)后第1、5、10、20天大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角,進(jìn)行western blot檢測總的STAT3和p-STAT3的蛋白表達(dá)水平;SMIR術(shù)前30min至術(shù)后第10天,每天一次鞘內(nèi)注射STAT3磷酸化抑制劑S3I-201,檢測大鼠術(shù)側(cè)PWT變化;將大鼠分為三組,一組為空白對照組,一組單純行SMIR手術(shù),還有一組行SMIR手術(shù)且預(yù)先鞘內(nèi)注射S3I-201直至術(shù)后第10天,western blot檢測三組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角p-STAT3和CX3CL1的蛋白表達(dá)水平,qPCR檢測三組大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角CX3CL1 mRNA表達(dá)水平。三、探討SMIR是否促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子STAT3和cx3cl1基因啟動(dòng)區(qū)域的結(jié)合將大鼠分為SMIR組和空白對照組,對術(shù)側(cè)脊髓背角進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)實(shí)驗(yàn),用 STAT3 抗體將可能與之結(jié)合的 DNA 片段拉下來,再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR和半定量PCR檢測。[結(jié)果]一、脊髓背角CX3CL1上調(diào)參與SMIR誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏SMIR術(shù)后第5天開始出現(xiàn)顯著的機(jī)械性痛覺過敏并維持到術(shù)后第20天。預(yù)先鞘內(nèi)注射CX3CL1中和性抗體能顯著緩解SMIR誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏,而對SMIR術(shù)后已產(chǎn)生顯著機(jī)械性痛覺過敏的大鼠再鞘內(nèi)注射CX3CL1中和性抗體則不能緩解已產(chǎn)生的痛覺過敏。SMIR術(shù)后第5、10、20天,術(shù)側(cè)脊髓背角CX3CL1蛋白和mRNA表達(dá)水平與空白對照組相比顯著上調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示,SMIR顯著激活脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞,而鞘內(nèi)注射CX3CL1中和性抗體能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。且SMIR術(shù)后,脊髓背角上調(diào)的CX3CL1表達(dá)在脊髓背角神經(jīng)元上但不表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上。二、STAT3介導(dǎo)了 SMIR誘導(dǎo)的脊髓背角CX3CL1的上調(diào)和機(jī)械性痛覺過敏SMIR術(shù)后,p-STAT3也主要表達(dá)在脊髓背角神經(jīng)元上但不表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上,且CX3CL1和p-STAT3存在大量共定位。SMIR術(shù)后第5、10、20天,術(shù)側(cè)脊髓背角STAT3磷酸化水平顯著上調(diào)。預(yù)先鞘內(nèi)注射STAT3磷酸化抑制劑S3I-201能顯著緩解SMIR誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏,并能抑制SMIR術(shù)后脊髓背角p-STAT3和CX3CL1蛋白水平的上調(diào),CX3CL1在mRNA水平的上調(diào)同樣受到抑制。三、SMIR可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子STAT3和cx3cl1基因啟動(dòng)區(qū)域的結(jié)合和空白對照組相比,ChIP結(jié)果表明SMIR可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子STAT3和cx3cl1基因啟動(dòng)區(qū)域的結(jié)合。[結(jié)論]SMIR術(shù)后,大鼠脊髓背角CX3CL1上調(diào)并參與SMIR誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏,STAT3激活并介導(dǎo)了 CX3CL1的上調(diào)和痛覺過敏,這可能是由于SMIR上調(diào)了 STAT3和cx3cl1基因啟動(dòng)區(qū)域的結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)了 CX3CL1的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R614
【圖文】：

結(jié)果逡逑髓背角ＣＸ３ＣＬ１上調(diào)參與ＳＭＩＲ誘誘導(dǎo)產(chǎn)生持續(xù)的機(jī)械性痛覺過敏逡逑模型，并在術(shù)前、術(shù)后］天、５天、１０天、％機(jī)械撤足閾值（ＰＷＴ邋），同批未行ＳＭＩＲ值相比，ＳＭＴＲ能夠引起術(shù)側(cè)產(chǎn)生顯著的側(cè)痛閾尚無明顯改變，術(shù)后第５天，術(shù)側(cè)５術(shù)后２０天。手術(shù)對側(cè)５０％ＰＷＴ無明顯變化－－

ＳＴＡＴ３介導(dǎo)ＣＸ３ＣＬ１上調(diào)在ＳＭＩＲ誘導(dǎo)術(shù)后慢性疼痛中的作用及機(jī)制研究逡逑到緩解，與單純行ＳＭＩＲ相比，ＰＷＴ沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與未行ＳＭＩＲ的對照組相逡逑比，ＰＷＴ明顯降低（圖２－Ｂ），提示ＣＸ３ＣＬ１可能并不參與ＳＭＩＲ誘導(dǎo)的痛覺過敏的逡逑維持。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑一邋－ｅ－邋ＳＭＩＲ邐千邋Ｃｏｎ邐＾邐－ｅ－邋ＳＭＩＲ邐－ｙ－邋Ｃｏｎ逡逑＾■３５－｜邋ＳＭＩＲ邋＋邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ邐＾邋３５＿｜邋－＊■邋ＳＭＩＲ邋＋邋Ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑ｏ邋３０－邐0邋３０－逡逑ｊ：邐ｊ：逡逑傮邋0■邐Ａｎｔｉｂｏｄｙ邐邐，0＿邐Ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑ｒａ邋－５邋ｉ邐１邐１邐１邐１邐１邐ｔｏ邋－５」邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ逡逑Ｑ－邐0邋１邐５邐１０邐１５邐２０邐０邐１邐５邐１０邐１５邐２０逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄａｙ）邐Ｔｉｍｅ邋（ｄａｙ）逡逑圖２鞘內(nèi)注射ＣＸ３ＣＬ１中和性抗體對ＳＭＩＲ誘導(dǎo)痛覺過敏的影響。（Ａ）預(yù)先鞘內(nèi)注逡逑射ＣＸ３ＣＬ１中和性抗體直至術(shù)后第１０天可緩解ＳＭＩＲ誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏（ｎ＝６，逡逑＊＝？＞＜０．０１，＊＝＞＜０．００１邋與邋ＳＭＩＲ邋組相比）。（Ｂ）邋ＳＭＩＲ邋術(shù)后邋１０邋天后鞘內(nèi)給予邋ＣＸ３ＣＬ１逡逑中和性抗體連續(xù)５天對大鼠己產(chǎn)生的機(jī)械性痛覺過敏無緩解作用（ｎ＝６，邋＾＜０．０１，逡逑＿ｐ＜０．００１與Ｃｏｎ組相比）逡逑３、ＳＭＩＲ誘導(dǎo)脊髓背角ＣＸ３ＣＬ１顯著上調(diào)并參與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活逡逑行為學(xué)結(jié)果提示ＣＸ３ＣＬ１參與ＳＭＩＲ誘導(dǎo)痛覺過敏的形成，進(jìn)一步行實(shí)時(shí)熒光逡逑定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）結(jié)果顯示

行為學(xué)結(jié)果提示ＣＸ３ＣＬ１參與ＳＭＩＲ誘導(dǎo)痛覺過敏的形成，進(jìn)一步行實(shí)時(shí)熒光逡逑定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）結(jié)果顯示，與對照組相比，ＳＭＩＲ術(shù)后第５天，脊髓背角ＣＸ３ＣＬ１逡逑在ｍＲＮＡ水平顯著上升，并維持到術(shù)后第２０天（圖３－Ａ）。又行ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ檢測，逡逑結(jié)果與ＰＣＲ相一致，ＳＭＩＲ誘導(dǎo)脊髓背角ＣＸ３ＣＬ１蛋白水平也顯著上調(diào)（圖３－Ｂ）。逡逑另外，免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示，與對照組相比，ＳＭＩＲ誘導(dǎo)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞逡逑激活，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Ｉｂａｌ熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)，而預(yù)先鞘內(nèi)給予ＣＸ３ＣＬ１中和性逡逑抗體后，ＳＭＩＲ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活受到明顯抑制，Ｉｂａｌ熒光信號強(qiáng)度與ＳＭＩＲ組逡逑相比顯著降低（圖３－Ｃ），提示上調(diào)的ＣＸ３ＣＬ１參與ＳＭＩＲ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。逡逑－２５－逡逑

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