發(fā)布時間：2020-08-11 19:17

【摘要】：研究背景:皮膚軟組織擴張術(shù)是整形外科治療軟組織缺損和畸形的一種重要方法。擴張過程中皮膚組織會產(chǎn)生一系列的改變,包括細胞的增殖與凋亡、細胞外基質(zhì)的合成與降解、新生血管的生成與退化等,在組織的上述改變中起到關(guān)鍵作用的影響因素可能是氧供。擴張過程中,源于擴張囊的壓力作用于局部被擴張的組織,使其發(fā)生形變、正常血液灌注受到影響,導(dǎo)致被擴張組織產(chǎn)生短暫或持續(xù)性的缺氧,在缺氧刺激下,組織會啟動修復(fù)過程(血管新生與退化、細胞增殖與凋亡、細胞外基質(zhì)合成與分解),從而恢復(fù)組織氧的供應(yīng)。臨床上存在的擴張方式有常規(guī)擴張、持續(xù)擴張、間斷快速擴張、恒壓擴張等,在不同擴張方式下,組織的缺氧程度、持續(xù)缺氧時間往往存在著明顯的差異。由此而造成的成纖維細胞增殖與凋亡、膠原合成與分解、新生血管的生成與退化等生物學(xué)特性都會發(fā)生相應(yīng)的改變,最終將直接影響擴張皮膚的質(zhì)量。本論文的第一部分介紹大鼠間斷及持續(xù)缺氧皮膚擴張模型構(gòu)建的實驗方法,應(yīng)用經(jīng)皮氧分壓對擴張組織氧供狀態(tài)進行監(jiān)測,并結(jié)合缺氧檢測試劑對不同程度缺氧擴張條件下的組織標(biāo)本進行免疫熒光染色,了解組織細胞缺氧狀況。結(jié)合HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)變化,證明擴張效果。希望能為擴張術(shù)的基礎(chǔ)研究提供一個成熟、穩(wěn)定的皮膚軟組織缺氧擴張動物模型。本論文的第二部分介紹間斷及持續(xù)缺氧擴張條件下皮膚真皮層組織學(xué)改變規(guī)律。對大鼠正常皮膚、間斷及持續(xù)缺氧擴張皮膚標(biāo)本行HE染色,光鏡下觀察各組皮膚組織學(xué)形態(tài),并測量各組真皮厚度;通過Masoon染色,測量真皮層單位面積膠原含量變化;通過PCAN及TUNEL染色,了解兩種缺氧擴張條件下真皮成纖維細胞的增殖及凋亡情況;行CD31染色,觀察真皮層血管形態(tài)及密度的改變。進而探討不同缺氧擴張條件下真皮層的組織學(xué)改變規(guī)律,了解維持不同缺氧條件擴張,是否能有效的誘導(dǎo)真皮層組織結(jié)構(gòu)改建,是否會對組織有損害作用,進而為臨床上尋找合適的擴張方式提供實驗依據(jù)。第一部分大鼠間斷及持續(xù)缺氧皮膚擴張模型的構(gòu)建目的:構(gòu)建大鼠背部間斷缺氧(Intermittent hypoxia,IH)及持續(xù)缺氧(Persistent hypoxia,PH)皮膚軟組織擴張模型,為皮膚軟組織擴張術(shù)的基礎(chǔ)研究提供穩(wěn)定的動物模型。方法:將16只體重200-250g的SD大鼠分為持續(xù)缺氧擴張組(IH組)及間斷缺氧擴張組(PH組),每組8只,每只大鼠背部近尾端肉膜層下置入1枚10 ml容量皮膚軟組織擴張器。IH組及PH組擴張過程中監(jiān)測經(jīng)皮氧分壓,通過注水調(diào)節(jié),維持擴張皮膚處于持續(xù)或間斷缺氧狀態(tài),擴張結(jié)束后采集各組擴張區(qū)域中央皮膚組織標(biāo)本,行HE染色,鏡下觀察皮膚結(jié)構(gòu)變化;應(yīng)用組織缺氧探針(Hypoxyprob-1)免疫熒光染色,并對各組真皮層缺氧成纖維細胞及總成纖維細胞計數(shù),計算缺氧細胞比率。結(jié)果:持續(xù)或間斷缺氧擴張過程中動物耐受良好、注水過程順利、無感染及皮膚壞死;組織切片HE染色后鏡下觀察見持續(xù)和間斷缺氧組擴張后皮膚表皮層較正常皮膚組明顯增厚,真皮層均變薄;擴張過程中實驗組經(jīng)皮氧分壓水平維持狀況穩(wěn)定;組織缺氧探針免疫熒光染色結(jié)果提示,正常皮膚組織標(biāo)本中未檢測到缺氧陽性真皮成纖維細胞,擴張后組織缺氧陽性真皮成纖維細胞顯著增加,持續(xù)缺氧擴張組較間斷缺氧擴張組缺氧陽性真皮層成纖維細胞比率高。間斷及持續(xù)缺氧擴張組之間組織缺氧程度差異明顯,能夠?qū)崿F(xiàn)間斷缺氧及持續(xù)缺氧擴張。結(jié)論:該動物模型有良好的穩(wěn)定性及可重復(fù)性,符合醫(yī)學(xué)動物模型制作的要求,此模型可用于間斷缺氧及持續(xù)缺氧擴張條件下真皮組織學(xué)變化規(guī)律的研究。第二部分間斷及持續(xù)缺氧擴張條件下皮膚真皮層組織學(xué)改變規(guī)律目的:研究皮膚軟組織擴張過程中,間斷缺氧及持續(xù)缺氧擴張后皮膚真皮層組織學(xué)改變規(guī)律。方法:選擇持續(xù)缺氧擴張、間斷缺氧擴張皮膚及正常皮膚標(biāo)本,行HE染色,光鏡下觀察真皮層結(jié)構(gòu)變化,應(yīng)用顯微標(biāo)尺測量HE染色切片中各組皮膚真皮層的厚度并在高倍鏡下行毛囊計數(shù);Masson染色了解真皮層膠原含量變化,并應(yīng)用病理圖像分析軟件對染色標(biāo)本進行平均灰度定量分析,以量化各組標(biāo)本中膠原纖維含量;應(yīng)用增殖細胞核抗原(PCAN)染色,測定真皮成纖維細胞增殖情況;應(yīng)用TUNEL染色,測定真皮成纖維細胞凋亡情況;CD31染色,了解真皮層血管形態(tài)及密度變化。結(jié)果:間斷及持續(xù)缺氧擴張后皮膚真皮層均變薄,毛囊稀疏,膠原增粗,排列方向趨于整齊。正常皮膚每高倍視野毛囊數(shù)為6.05±0.94個,IH組每高倍視野毛囊數(shù)為3.50±0.62個,PH組每高倍視野毛囊數(shù)為3.30±0.78個。擴張后組織真皮層每高倍視野下毛囊個數(shù)明顯減少,但IH組和PH組統(tǒng)計結(jié)果無顯著差異(P0.05);對各組標(biāo)本真皮層厚度進行測量,結(jié)果提示:IH組真皮厚度為500.2±22.57μm,PH組為464.3±27.23μm,正常皮膚組為759.4±27.23μm。IH組及PH組真皮層均較正常皮膚變薄,其中PH組較IH組明顯變薄,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各組標(biāo)本Masoon染色,并對真皮層內(nèi)代表膠原纖維的藍色像素值進行統(tǒng)計,結(jié)果提示:正常皮膚組像素值平均為199769±6027 pixels;IH組像素值平均為257557±4648 pixels,PH組像素值平均為220401±7298 pixels,IH組及PH組均較正常皮膚真皮層單位面積膠原含量增高,且IH組較PH組增高明顯,兩組數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。正常皮膚真皮層PCNA陽性成纖維細胞的細胞密度為6.1個/高倍視野,IH組為19.38個/高倍視野,PH組為個15.82/高倍視野,IH組PCNA陽性細胞較PH組高,兩組數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TUNEL染色結(jié)果提示,正常皮膚真皮成纖維細胞凋亡細胞密度為5.1個/高倍視野,IH組為16.05個/高倍視野,PH組為13.05個/高倍視野。IH組TUNEL陽性成纖維細胞密度較PH組升高,但兩組數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。CD31對各組皮膚標(biāo)本行組織化學(xué)染色,并在高倍鏡下對真皮層血管進行計數(shù),結(jié)果提示:間斷缺氧擴張組每高倍視野毛細血管平均值為22.87±1.13個,持續(xù)缺氧擴張組為13.57±0.43個,兩組數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.擴張后皮膚真皮層單位面積內(nèi)毛囊計數(shù)較正常皮膚減少,可能與皮膚牽拉后皮膚附件的間距增加有關(guān)。2.間斷缺氧擴張組真皮層厚度大于持續(xù)缺氧擴張組,且單位面積內(nèi)膠原含量較持續(xù)缺氧組高,這與間斷缺氧擴張更有效的刺激真皮成纖維細胞增殖、降低細胞凋亡、促進膠原合成有關(guān)。間斷缺氧擴張組真皮層新生血管密度較持續(xù)缺氧擴張組明顯增加,說明間斷缺氧能夠更有效促進真皮血管網(wǎng)的重構(gòu),為擴張組織提供更多氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)。3.間斷缺氧擴張更有利于擴張皮膚的生物性生長,為臨床修復(fù)重建提供更多材料。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R622
【圖文】：

圖 1.大鼠背部擴張器置入 a、b.術(shù)前設(shè)計 c.擴張器置入后即刻 d.術(shù)后 1 周(注水10ml)Fig 1. Expander implant surgery a、b. Preview design c. Postview at once oexpander implant d. Postview at 1 week ( injected saline 10ml )2.2 經(jīng)皮養(yǎng)分壓檢測方法及原理皮膚的經(jīng)皮氧分壓用瑞典 PERIMED AB 公司生產(chǎn)的 Perifux 5000 系統(tǒng)的經(jīng)皮氧分壓（TcpO2）模塊進行檢測。臨床上，經(jīng)皮氧分壓常用于監(jiān)測人體全身呼吸或局部的血流灌注情況。其原理是經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測探頭通過對局部皮膚進行加熱，致使該部位毛細血管擴張，受熱區(qū)域血液中的氧氣通過皮膚透出進入接觸液，探頭監(jiān)測接觸液中氧濃度，由此反映從毛細血管透過表皮彌散出來的氧氣的含量。2.2.1 經(jīng)皮養(yǎng)分壓檢測操作步驟1) 在經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測開始前需先行系統(tǒng)校準，Perifux5000 系統(tǒng)的電極（探頭）采

圖 2 經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測設(shè)備 a. 經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測探頭（▲） b. 經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測儀Fig 2 Transcutaneous oxygen monitoring equipment a. Transcutaneous oxygemonitoring probe (▲) b. Transcutaneous oxygen monitor2.2.2 擴張皮瓣經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測臨界值選擇擴張器置入術(shù)后 1 周開始注水?dāng)U張。擴張過程中根據(jù)經(jīng)皮氧分壓的監(jiān)測情況判斷皮膚缺氧狀態(tài)，同時在注水?dāng)U張過程中應(yīng)確保擴張皮膚中央的血液供應(yīng)處于安全范圍內(nèi)，否則將會導(dǎo)致皮膚缺血壞死、擴張器外露等并發(fā)癥，使模型構(gòu)建成功率下降。根據(jù)既往文獻報道，擴張過程中當(dāng)囊內(nèi)壓< 8kPa（約 60mmHg）時，擴張皮瓣微循環(huán)未被阻斷，皮瓣血運相對安全[53-54]。在預(yù)實驗（體內(nèi)試驗）中發(fā)現(xiàn)，在擴張器持續(xù)注水?dāng)U張過程中，擴張囊內(nèi)總注水量達 25ml 左右時，擴張器囊內(nèi)壓可達 8kPa,此時經(jīng)皮氧分壓平均值為 1.4±0.25mmHg(圖 4)。首次注水使擴張囊總?cè)萘窟_ 25ml 后維持注水量不變，持續(xù)經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮氧分壓在 24 小時內(nèi)可維持在

圖 3 持續(xù)注水?dāng)U張囊內(nèi)壓監(jiān)測（體內(nèi)）Fig 3 Measureing the internal pressure of expander during expansio張皮瓣經(jīng)皮氧分壓監(jiān)測及擴張器注水方法斷缺氧擴張組：注水過程中監(jiān)測經(jīng)皮氧分壓，當(dāng)經(jīng)皮氧分壓下降<3水，監(jiān)測氧分壓變化，待經(jīng)皮氧分壓恢復(fù)或接近未擴張前皮膚經(jīng)皮再次注水，使經(jīng)皮氧分壓下降<3mmHg，如此反復(fù)擴張。擴張囊內(nèi)總停止注水。續(xù)缺氧擴張組：注水時監(jiān)測經(jīng)皮氧分壓，當(dāng)經(jīng)皮氧分壓下降<3mmH并持續(xù)監(jiān)測經(jīng)皮氧分壓，當(dāng)經(jīng)皮氧分壓接近 3mmHg 時再次注水，使維持在 1-3mmHg 之間。擴張囊內(nèi)注水總量約 70ml 后停止注水�？棙�(biāo)本的采集與處理到預(yù)定擴張量后進行取材，取材部位位于擴張皮膚區(qū)域中心，取材前

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本文編號：2789459