【摘要】：目的:探討不同時(shí)間點(diǎn)的癱瘓大鼠脊髓提取液對新生大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖分化的影響。方法:(1)新生大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的取材、分離、培養(yǎng)、鑒定、傳代培養(yǎng)至第五代,備用。[18,19,20]。(2)將15只健康的雌性成年SD大鼠分成三組,每組5只:癱瘓組用WD法制作T9平面完全性截癱的SD大鼠脊髓損傷模型,假手術(shù)組在相同節(jié)段僅做椎板開窗,正常組不做處理,造模8、24、72h,5、7、14 d后制備各組脊髓提取液。(3)將傳至第5代的新生鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞分為9個組培養(yǎng):A組-空白對照組(即培養(yǎng)基中加入PBS液共同培養(yǎng)),B組-正常組(即培養(yǎng)基中加入正常脊髓提取液共同培養(yǎng)),C組-假手術(shù)組(即培養(yǎng)基中加入假手術(shù)脊髓提取液共同培養(yǎng)),D組-癱瘓1組(即培養(yǎng)基中加入8h癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)),E組-癱瘓2組(即培養(yǎng)基中加入24h癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)),F組-癱瘓3組(即培養(yǎng)基中加入72h癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)),G組-癱瘓4組(即培養(yǎng)基中加入5d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)),H組-癱瘓5組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)),I組-癱瘓6組(即培養(yǎng)基中加入14d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))。(4)共同培養(yǎng)1、2、3、4、5 d,用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測每個高倍鏡下NSC的數(shù)目來反映不同癱瘓脊髓提取液對NSC增殖能力的影響;共同培養(yǎng)24、48h,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)檢測Notch1、Hes1的表達(dá)。結(jié)果:(1)新生SD大鼠(2-3 d內(nèi))腦源性細(xì)胞在體外可以大量擴(kuò)增、形成球狀團(tuán)聚物,而且可以連續(xù)的、穩(wěn)定的傳代,培養(yǎng)到第5代的細(xì)胞Nestin免疫熒光染色(+)[7]。(2)培養(yǎng)后1d各組神經(jīng)干細(xì)胞的MTT值,A組為0.1317±0.0250,B組為0.1424±0.0331,C組為0.1487±0.0303,D組為0.1939±0.1613,E組為0.1839±0.1513,F組為0.887±0.115,G組為0.937±0.145,H組為0.2139±0.1733,I組為0.1899±0.1589;其中H組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))細(xì)胞MTT值顯著增高,高于其他8組(P0.05);第2 d各組MTT值:A組為0.1860±0.0187,B組為0.1813±0.0324,C組為0.1955±0.0311,D組為1.213±0.025,E組為1.287±0.031,F組為0.2287±0.0313,G組為1.403±0.025,H組為0.2864±0.0253,I組為1.313±0.025,H組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))細(xì)胞MTT值顯著增高,高于其他8組(P0.05);第3 d各組MTT值:A組為0.2378±0.0288,B組為0.2452±0.0310,C組為0.2276±0.0273,D組為0.2911±0.3306,E組為0.2951±0.3106,F組為0.2851±0.3106,G組為0.3116±0.3376,H組為0.3217±0.3276,I組為0.2811±0.2913,H組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))細(xì)胞MTT值顯著增高,高于其他8組(P0.05);第4 d各組MTT值:A組為0.2865±0.0238,B組為0.2806±0.0337,C組為0.3070±0.0197,D組為0.3533±0.0274,E組為0.3733±0.0284,F組為0.3633±0.0287,G組為0.3733±0.0268,H組為0.3812±0.0297,I組為0.3511±0.0274,H組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))細(xì)胞MTT值顯著增高,高于其他8組(P0.05);第5 d各組MTT值:A組為0.3224±0.0175,B組為0.3094±0.0273,C組為0.3149±0.0173,D組為0.3831±0.0166,E組為0.3931±0.0216,F組為0.3911±0.0197,G組為0.4331±0.0182,H組為0.4376±0.0232,I組為0.3831±0.0147,H組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))細(xì)胞MTT值顯著增高,高于其他8組(P0.05)。A、B、C組之間每個高倍鏡下在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞MTT值沒有明顯差異(P0.05)。各個癱瘓組的MTT值均顯著高于A、B、C組(P0.05),其中癱瘓組中癱瘓5組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))各時(shí)間段點(diǎn)細(xì)胞MTT值顯著增高,高于其他8組(P0.05)。(3)各組24h Notch1m RNA的表達(dá):A組為1.003±0.099,B組為1.175±0.162,C組為1.076±0.212,D組為1.312±0.333,E組為1.879±0.148,F組為2.325±0.427,G組為2.712±0.183,H組為3.800±0.495,I組為3.107±0.278;各組48h Notch1m RNA的表達(dá)A組為1.003±0.099,B組為1.203±0.170,C組為1.063±0.067,D組為1.629±0.249,E組為2.108±0.136,F組為3.035±0.128,G組為4.132±0.574,H組為7.217±0.279,I組為4.191±0.291。各組24h Hes1m RNA的表達(dá)A組為1.016±0.212,B組為1.146±0.213,C組為1.156±0.352,D組為1.540±0.386,E組為1.875±0.084,F組為2.207±0.199,G組為3.960±0.569,H組為4.659±0.422,I組為3.602±0.495;各組48h Hes1 m RNA的表達(dá)情況:A組為1.010±0.176,B組為1.177±0.119,C組為1.282±0.462,D組為2.213±0.756,E組為2.735±0.599,F組為3.725±0.294,G組為5.302±1.192,H組為7.675±0.838,I組為6,302±0.637,整個癱瘓組24h和48h的Notch1、Hes1 m RNA的表達(dá)比A、B、C三組強(qiáng)(P0.05),而A、B、C組24h和48h的Notch1、Hes1 m RNA的表達(dá)基本沒有明顯的差異(P0.05)。在癱瘓組中,H組-癱瘓5組(即培養(yǎng)基中加入7d癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng))在各個時(shí)間點(diǎn)的Notch1、Hes1 m RNA的表達(dá)明顯高于其他8組(P0.05)。結(jié)論:(1)新生SD大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞不僅具有擴(kuò)增、分化成多類神經(jīng)細(xì)胞的能力,表達(dá)原始神經(jīng)細(xì)胞的表面標(biāo)記物Nestin,符合NSC的判定。(2)癱瘓脊髓提取液可以上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞Notch1和Hes1 m RNA的表達(dá)水平、促進(jìn)NSC的增殖,可模擬SCI后的微環(huán)境。(3)SCI后,7d的脊髓提取液促進(jìn)大鼠腦NSC的增殖以及Notch1和Hes1 m RNA的作用最強(qiáng),且隨共培養(yǎng)的時(shí)間增加而增加,因此推測在脊髓損傷的第7d封閉Notch信號可能是促進(jìn)內(nèi)源性NSC增殖的最佳時(shí)機(jī)。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2
【圖文】：

圖 1. 新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞一般生長情況(倒置相差顯微鏡)A：原代培養(yǎng)第 24 小時(shí)（100×）B：原代培養(yǎng)第 3 天（100×）C：原代培養(yǎng)第 5 天（×100）D：原代培養(yǎng)第 8 天（E：傳至第 5 代培養(yǎng)第F ：誘導(dǎo)分化后第 5 Figure1. General character of newborn rat , s NSC （ invcontrast microscope）A: primary culture 24 hours(×100)B: primary culture 3 days (×100)C: primary culture 5 days (×100)E: to fifth generatiodays (×200)F: 5days after di(×200

圖 2: nestin 免疫熒光染色（紅色熒光×13.2. 大鼠脊髓組織 HE 染色正常脊髓: 正常的脊髓，可見組織白質(zhì)分界清楚，灰質(zhì)細(xì)胞分布均勻白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維沿脊髓縱軸方向排損傷后 8 小時(shí): 灰白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)區(qū)分，可見有少許紅細(xì)胞滲出.(圖損傷后 24 小時(shí):脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂紅細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元數(shù)目減少、殘損傷后 72 小時(shí): 灰、白質(zhì)分界不

西 南 醫(yī) 科 大 損傷后 7 天: 水腫和出血得到改善減少，出現(xiàn)壞死組織細(xì)胞碎片，灰域可見膠質(zhì)細(xì)胞增生，毛細(xì)血管形損傷后 14 天: 脊髓組織排列疏松洞及膠質(zhì)瘢痕形成. (圖 4G)

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2 汪華僑,席剛明,洪衍波;人胚脊髓提取液對胚鼠脊髓運(yùn)動神經(jīng)元存活與生長的影響[J];中國體視學(xué)與圖像分析;1999年03期

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7 楊浩,梁U

本文編號：2787903