【摘要】：目的創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)會引起組織丟失和嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,目前幾乎沒有有效的治療方法。大腦由灰質(zhì)和白質(zhì)組成,而灰質(zhì)主要由神經(jīng)元的胞體、突觸和星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成,白質(zhì)主要由神經(jīng)纖維和外面包裹的少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的髓鞘構(gòu)成。TBI不僅造成神經(jīng)元和突觸損害,還能引起軸突損傷和少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在TBI后發(fā)揮重要作用,但調(diào)節(jié)它們的分子機制目前仍不十分清楚。有研究報道,A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種有害的星形膠質(zhì)細(xì)胞表型,可以誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡和突觸丟失,可以被小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子激活。白質(zhì)損傷的修復(fù)也受到小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)是一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化。維甲酸X受體(retinoid X receptor,RXR)是一種核內(nèi)受體,可以和PPARγ組成異二聚體,調(diào)控靶基因功能。貝沙羅汀是一種高選擇性的RXR激動劑,T0070907是一種選擇性的PPARγ抑制劑,均可以通過血腦屏障。本研究通過建立小鼠TBI模型,給予貝沙羅汀并檢測其對大腦皮層和海馬所代表的灰質(zhì)以及胼胝體、內(nèi)囊和外囊代表的白質(zhì)的保護作用,并探討其對星形膠質(zhì)細(xì)胞表型、小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響,探究PPARγ參與的相關(guān)機制。方法1、C57BL/6J小鼠72只隨機分為四組:假手術(shù)組(n=18)、安慰劑組(n=18)、貝沙羅汀組(n=18)、貝沙羅汀+T0070907組(n=18)。采用控制性皮質(zhì)損傷(controlled cortical impact,CCI)法建立小鼠TBI模型。CCI后每天腹腔注射貝沙羅汀或安慰劑、PPARγ的拮抗劑T0070907和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)。神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分(neurological severity scores,NSS)和水迷宮實驗驗證貝沙羅汀對TBI后小鼠的感覺運動功能和學(xué)習(xí)記憶功能的影響。建模后14天免疫熒光檢測神經(jīng)元存活和突觸密度,檢測軸突再生、髓鞘完整性和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)的數(shù)量。Western blot檢測突觸前蛋白標(biāo)記物synaptophysin和突觸后蛋白標(biāo)記物突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)的表達(dá),檢測生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43,GAP43)和髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達(dá)。2、C57BL/6J小鼠180只隨機分為四組:假手術(shù)組(n=41)、安慰劑組(n=49)、貝沙羅汀組(n=49)、貝沙羅汀+T0070907組(n=41)。采用CCI法建立小鼠TBI模型。CCI后每天腹腔注射貝沙羅汀或安慰劑或T0070907。免疫熒光檢測A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和cleaved caspase-3陽性細(xì)胞數(shù),檢測M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表達(dá)。Western blot檢測A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、小膠質(zhì)細(xì)胞來源的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、補體成分1q亞單位α鏈(complement component 1 q subcomponentαchain,C1qα)和BNDF的表達(dá)、M1型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞來源的TNF-α、IL-1α和C1qα的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)水平,檢測M1型小膠質(zhì)細(xì)胞和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的mRNA水平。Western blot檢測RXRα和PPARγ的核轉(zhuǎn)位,轉(zhuǎn)錄活性試驗檢測PPARγ依賴的轉(zhuǎn)錄,探討貝沙羅汀影響小膠質(zhì)細(xì)胞極化的作用機制。3、C57BL/6J小鼠45只隨機分為PBS組(n=9)、IgG組(n=9)、TNF-α中和抗體(anti-TNF-α)組(n=9)、IL-1α中和抗體(anti-IL-1α)組(n=9)和C1qα中和抗體(anti-C1qα)組(n=9)。采用CCI建立小鼠TBI模型,側(cè)腦室注射TNF-α中和抗體、IL-1α中和抗體、C1qα中和抗體、PBS或IgG。免疫熒光檢測A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,Western blot檢測A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá),探討TNF-α、IL-1α和C1qα對A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。4、C57BL/6J小鼠25只隨機分為對照組(n=5)、TBI后第1天組(n=5)、TBI后第3天組(n=5)、TBI后第7天組(n=5)和TBI后第14天組(n=5),采用CCI建立小鼠TBI模型,Western blot檢測RXRα和PPARγ分別在總蛋白、胞漿中和核中的表達(dá)。結(jié)果1、與安慰劑組相比,貝沙羅汀組小鼠感覺運動功能和學(xué)習(xí)記憶功能明顯改善。TBI后14天,貝沙羅汀促進(jìn)神經(jīng)元存活,增加突觸密度,促進(jìn)軸突再生,保存髓鞘完整性,促進(jìn)OPC增殖。T0070907減輕了貝沙羅汀的這些作用。2、與給予安慰劑相比,TBI后14天,貝沙羅汀組A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞凋亡明顯減少,小膠質(zhì)細(xì)胞來源的TNF-α、IL-1α和C1qα表達(dá)的表達(dá)明顯降低,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞極化減少,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化增加。小膠質(zhì)細(xì)胞來源的BDNF的表達(dá)增加。T0070907部分消除了貝沙羅汀的這些作用。與PBS對照組相比,TNF-α中和抗體組、IL-1α中和抗體組和C1qα中和抗體組的A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。3、TBI后RXRα和PPARγ在胞漿中的表達(dá)先降低后升高,在核內(nèi)的表達(dá)先升高后降低。TBI后14天,與安慰劑組相比,貝沙羅汀組RXRα和PPARγ在胞漿中的表達(dá)明顯降低,在核內(nèi)的表達(dá)明顯升高。T0070907沒有影響貝沙羅汀對RXRα的作用,但消除了它對PPARγ的作用。TBI后PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加。與安慰劑組相比,貝沙羅汀增加了PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性,而T0070907減輕了貝沙羅汀的這種作用。結(jié)論1、貝沙羅汀可以促進(jìn)小鼠TBI后神經(jīng)元存活,增加突觸密度,促進(jìn)軸突再生,保持髓鞘完整性,改善神經(jīng)功能。2、貝沙羅汀的神經(jīng)保護作用可能與其減少A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞從M1型向M2型極化有關(guān)。3、貝沙羅汀的作用可能部分通過促進(jìn)PPARγ的核轉(zhuǎn)位和其依賴的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.15
【圖文】：

與假手術(shù)小鼠相比，CCI明顯增加了小鼠NSS評分。傷后第1天最重，第21天逐漸改善。貝沙羅汀明顯改善了小鼠CCI后NSS評分。與貝沙羅汀組相比，貝沙羅汀+T0070907組顯示了明顯增加的NSS評分（圖1.1）。

我們進(jìn)行了水迷宮試驗（圖1.2）。從CCI后第16天到第20天，CCI小鼠的平臺潛伏期比假手術(shù)小鼠明顯增加。與安慰劑組相比，貝沙羅汀組小鼠的平臺潛伏期明顯減少（p<0.05）。然而，貝沙羅汀+T0070907組的小鼠的潛伏期明顯長于貝沙羅汀組（p<0.05）（圖1.3）。與假手術(shù)組相比，正確象限所用時間比例在安慰劑組明顯降低（p<0.05），而貝沙羅汀明顯增加了這一比例（p<0.05）。PPARγ拮抗劑T0070907逆轉(zhuǎn)了貝沙羅汀的這一作用（p<0.05）（圖1.4）。在CCI后第21天的探針試驗中，與假手術(shù)小鼠相比，安慰劑治療的CCI小鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少（p<0.05），而貝沙羅汀增加了CCI小鼠穿越平臺的次數(shù)（p<0.05）。用T0070907抑制PPARγ后

從CCI后第16天到第20天，CCI小鼠的平臺潛伏期比假手術(shù)小鼠明顯增加。與安慰劑組相比，貝沙羅汀組小鼠的平臺潛伏期明顯減少（p<0.05）。然而，貝沙羅汀+T0070907組的小鼠的潛伏期明顯長于貝沙羅汀組（p<0.05）（圖1.3）。與假手術(shù)組相比，正確象限所用時間比例在安慰劑組明顯降低（p<0.05），而貝沙羅汀明顯增加了這一比例（p<0.05）。PPARγ拮抗劑T0070907逆轉(zhuǎn)了貝沙羅汀的這一作用（p<0.05）（圖1.4）。在CCI后第21天的探針試驗中，與假手術(shù)小鼠相比，安慰劑治療的CCI小鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少（p<0.05），而貝沙羅汀增加了CCI小鼠穿越平臺的次數(shù)（p<0.05）。用T0070907抑制PPARγ后，小鼠穿越平臺的次數(shù)較只用貝沙羅汀的小鼠明顯減少（p<0.05）（圖1.5）。

【參考文獻(xiàn)】

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1 羅春霞;易斌;陳渝杰;李博;唐衛(wèi)華;劉智;陳志;朱剛;馮華;;膠質(zhì)細(xì)胞活化在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2011年12期

本文編號：2786461