【摘要】：背景:隨著組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,構(gòu)建組織工程毛囊將會(huì)是治療禿發(fā)較有前景的方法。毛乳頭細(xì)胞(DPCs)是毛囊再生重要的種子細(xì)胞。但是,DPCs經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后其誘導(dǎo)能力逐漸喪失。許多方法用于維持或者恢復(fù)體外培養(yǎng)的DPCs的誘導(dǎo)能力。但是,短時(shí)間內(nèi)要獲取足夠數(shù)量的且具有誘導(dǎo)能力的DPCs仍比較困難。目前,組織工程毛囊的研究均處于實(shí)驗(yàn)階段,DPCs通常來源于小鼠的觸須毛囊或者是手術(shù)廢棄的人頭皮毛囊,其來源非常有限。因此,我們嘗試分離并培養(yǎng)小鼠背毛DPCs以期提供一種新的DPCs來源。目的:(1)分離、培養(yǎng)C57小鼠背毛DPCS(2)檢測(cè)體外培養(yǎng)的C57小鼠背毛DPCs誘導(dǎo)能力(3)探討培養(yǎng)的背毛DPCs用于毛囊重建的可行性方法:(1)C57小鼠背毛DPCs的分離與培養(yǎng)取5w C57BL/6小鼠背部皮膚,經(jīng)酶消化及Ficoll密度梯度離心后分離獲取毛乳頭(DP),顯微鏡下觀察DP外觀、貼壁及細(xì)胞遷出情況,計(jì)算DP貼壁率。觀察傳代細(xì)胞生長情況。(2)體外培養(yǎng)的C57小鼠背毛DPCs誘導(dǎo)能力的檢測(cè)取P3代的小鼠背毛DPCs、觸須DPCs及真皮成纖維細(xì)胞(Fbs),分別采用qRT-PCR、免疫熒光。(3)體外培養(yǎng)的背毛DPCs用于毛囊重建分別取P3代小鼠背毛DPCs、觸須DPCs及Fbs結(jié)合新生鼠上皮細(xì)胞用于毛囊重建。分別于移植后4周對(duì)移植部位進(jìn)行組織取材,對(duì)移植部位進(jìn)行大體觀察、組織切片HE染色觀察。結(jié)果:(1)C57小鼠背毛DPCs的分離與培養(yǎng)經(jīng)酶消化及Ficoll密度梯度離心后獲取的DP呈圓形或橢圓形,24h貼壁率達(dá)90%。傳代后的DPCs呈明顯長梭形,漩渦樣生長,隨著傳代次數(shù)增加,DPCs逐漸失去凝集性生長能力。(2)體外培養(yǎng)的C57小鼠背毛DPCs誘導(dǎo)能力的檢測(cè)qRT-PCR、免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果表明:體外培養(yǎng)的小鼠背毛DPCs可表達(dá)ALP、β-catenin和Versican在內(nèi)的與誘導(dǎo)能力相關(guān)的細(xì)胞標(biāo)記物基因及蛋白,且與觸須DPCs表達(dá)無明顯差異,與Fbs表達(dá)有明顯差異。(3)體外培養(yǎng)的背毛DPCs用于毛囊重建將Fbs與新鮮表皮細(xì)胞聯(lián)合移植或者僅表皮細(xì)胞單獨(dú)移植均未能重建出毛囊。將培養(yǎng)的背毛DPCs或者觸須DPCs與新鮮表皮細(xì)胞聯(lián)合移植后均能重建出毛囊。結(jié)論:(1)通過酶消化結(jié)合Ficoll梯度離心法可分離獲得小鼠背毛DP,該方法具有高收獲率、高分離效率、低勞動(dòng)強(qiáng)度和高貼壁遷出率的優(yōu)點(diǎn);且該方法并未明顯影響DPC在體外培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞形態(tài)、生長方式。(2)qRT-PCR、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí),體外培養(yǎng)的小鼠背毛DPCs可表達(dá)與毛囊誘導(dǎo)能力相關(guān)的特異性標(biāo)記物ALP、β-catenin及Versican,且與觸須DP相比并無明顯差異。(3)體外培養(yǎng)的小鼠背毛DPCs具有誘導(dǎo)毛囊再生的能力,可用于毛囊重建的實(shí)驗(yàn)研究。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R62
【圖文】：

體外培養(yǎng)的Ｃ５７小鼠背毛ＤＰＣ呈長梭形，外形與成纖維細(xì)胞類似，但有較多逡逑觸角伸出。低傳代的ＤＰＣ可觀察到明顯的聚集性生長現(xiàn)象，Ｐ４代以前的毛乳頭細(xì)逡逑胞聚集性生長現(xiàn)象非常明顯（圖２ａ），但是隨著傳代次數(shù)的增加，ＤＰＣ聚集性生長逡逑現(xiàn)象逐漸消失，Ｐ６代以后的ＤＰＣ聚集性生長特性不明顯（圖２ｂ），尤其是Ｐ１０代的逡逑毛乳頭細(xì)胞生長緩慢可觀察到細(xì)胞衰老的征象。Ｐ１－Ｐ４代ＤＰＣ生長達(dá)８０％融合時(shí)，逡逑細(xì)胞呈現(xiàn)特有的旋渦狀圖案（圖２ｃ），但是Ｐ６代以后或者更高代數(shù)的毛乳頭細(xì)胞，逡逑其旋渦狀生長圖案并不明顯。逡逑２．３邐ＤＰＣ活力檢測(cè)逡逑實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)不同代數(shù)的ＤＰＣ增殖能力進(jìn)行了檢測(cè)，通過ＣＣＫ８法測(cè)定了逡逑Ｐ１－Ｐ８代ＤＰＣ的吸光度并繪制呈生長曲線圖（圖３）。發(fā)現(xiàn)各代細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)逡逑間的延長，均出現(xiàn)明顯X椫誠窒螅壞牽煌南赴湓鮒襯芰浯嬖誆鑠義弦歟校炒暗模模校悶湓鮒襯芰ξ廾饗圓鉅歟校醇捌湟院蟠南赴湓鮒沖義夏芰γ饗越希校炒鄖暗南赴檔�。辶x希跺義

本文編號(hào)：2786222