【摘要】：目的通過將miRNA-21-5p轉(zhuǎn)染到成骨細(xì)胞MV3T3-E1中,檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染濃度及轉(zhuǎn)染時(shí)間轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞后miRNA-21-5p含量的變化,同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞分化蛋白:骨鈣蛋白、P1NP和RUNX2含量的變化;同時(shí)檢測(cè)不同時(shí)間和轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞MV3T3-E1后成骨細(xì)胞外基質(zhì)礦化程度,從而揭示miRNA-21-5p與成骨細(xì)胞分化和礦化的相關(guān)性,為臨床治療骨折不愈合、骨質(zhì)疏松藥物的研究和開發(fā)提供新的作用靶點(diǎn),具有重要的價(jià)值。方法成骨細(xì)胞來源于ATCC(洛克威樂,馬里蘭州,美國),使用15%血清的DMEN培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37℃、CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)、傳代。采用RT-PCR方法對(duì)mRNA進(jìn)行定量分析,內(nèi)參為U6。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimics,將miR-21-5p基因編碼序列克隆到pcDNA3.1(+)質(zhì)粒載體上,使用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-21-5p的靶點(diǎn)。mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后進(jìn)行ECM礦化試驗(yàn)。使用分光光度計(jì)測(cè)定450 nm處溶液的光密度值。使用堿性磷酸酶二乙醇胺活性試劑盒檢測(cè)堿性磷酸酶的相對(duì)活性。采用Western blot法測(cè)定SMAD7蛋白水平表達(dá)。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimics能提高miR-21-5p體外水平。30 nM miR-21-5p mimics轉(zhuǎn)染0、1、3、6、12或24小時(shí)后,miR-21-5p相對(duì)水平隨著時(shí)間的延長,含量逐漸升高。與對(duì)照組比較,miR-21-5p mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞12小時(shí)后,骨鈣素、P1NP和RUNX2的mRNA水平顯著升高(p0.05)。miR-21-5p與成骨細(xì)胞標(biāo)記物(骨鈣素、P1NP、RUNX2)水平呈正相關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)礦化實(shí)驗(yàn)顯示,30或60 nM的miR-21-5p mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞12小時(shí)后,其礦化節(jié)點(diǎn)的形成顯著上調(diào),礦化點(diǎn)的OD 450值增加。miR-21-5p mimics轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細(xì)胞中,細(xì)胞成骨早期的標(biāo)志物堿性磷酸酶活性顯著增高。雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示:轉(zhuǎn)染3'UTR、miR-21-5p mimics(30nM或60nM)與pLuc-SMAD7 3’UTR與對(duì)照(30nM或60nM)相比,其雙熒光素酶相對(duì)活性存在顯著的降低了。然而,pLuc-SMAD7 3'UTR與miR-21-5p mimics轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細(xì)胞中,30 nM和60 nM組相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果表明,miR-21-5p mimics通過靶向SMAD7的3'UTR降低了MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性,即miR-21-5p靶向SMAD7的3'UTR。進(jìn)一步Western blot顯示,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中SMAD7的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組細(xì)胞。結(jié)論1.miR-21-5p促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物(骨鈣蛋白和P1NP,RUNX2,堿性磷酸酶)的生成,促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。2.miR-21-5p通過靶向SMAD7的3'UTR端發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。3.miR-21-5p可能是促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抑制骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合的重要調(diào)控分子。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R683;R580
【圖文】：

成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)Figure1Primarycultureofosteoblasts

24圖 1.2 miRNA-21-5p 不同轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞后其 miRNA-21-5p 表達(dá)的變化Figure 1.2 Changes of miRNA-21-5p expression in osteoblasts after transfecting with differenconcentrations of miRNA-21-5p

圖 1.3 30nM miRNA-21-5p 轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其 miRNA-21-5p 的差異經(jīng)比較轉(zhuǎn)染 3 h 后顯著增加,而且水平穩(wěn)定在直到 24 hFigure 1.3 The difference of miRNA-21-5p in 30nM miRNA-21-5p transfected osteoblasts atdifferent time points increased significantly after transfection at 3 hours, and the level wasstable until 24 hours

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2782514