【摘要】：前言肝臟移植是治療終末期肝病最有效的手段,但供肝來源短缺與等待肝臟移植患者數(shù)量之間的矛盾仍是目前全球器官移植面對的難題,國外20世紀60年代開始利用心臟循環(huán)死亡后器官捐獻(Donation after Cardio-circulatory Death,DCD)供體,之后被腦死亡后器官捐獻(Donation after Brain Death,DBD)供體所取代,直到20世紀80年代,歐美移植中心重新關(guān)注DCD供體。與DBD供體相比,DCD供肝術(shù)后發(fā)生移植物原發(fā)性無功能(primary non-function,PNF)、肝動脈血栓形成(hepatic artery thrombosis,HAT)等嚴重并發(fā)癥機會明顯增加,這與在心臟停跳過程中發(fā)生復(fù)雜缺血、缺氧條件所導(dǎo)致的熱損傷明顯相關(guān)。因此對于DCD供肝的質(zhì)量評估顯的尤為重要,以避免放棄可用供肝造成的器官浪費,以及應(yīng)用不適合供肝造成嚴重不良后果。目前對DCD供肝質(zhì)量評估方式主要有冷-熱缺血時間、脂肪肝程度、供者血鈉水平、年齡、肝炎感染、腫瘤等方面,仍沒有一種客觀反映供肝損傷程度及預(yù)測預(yù)后的指標,因此,尋找一種敏感、客觀的評估指標是目前DCD肝臟移植面臨的一個嚴峻問題。miRNA-122是miRNA家族的一員,約占肝臟細胞中總miRNA的70%,且在其他組織中檢測不到,胚胎時期,肝臟細胞中miRNA-122水平開始升高,在成年鼠肝臟中,每個細胞中含量可達到66000拷貝,人的肝細胞中可達到135000拷貝,miRNA-122序列從人到斑馬魚都是高度保守的,而且斑馬魚的原位雜交也說明miRNA-122肝臟特異性也是高度保守的。miRNA-122參與肝臟的發(fā)育分化、基因表達調(diào)控和功能代謝,研究表明其與非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝細胞癌、藥物性肝損傷均有明顯相關(guān)性,近年來隨著對miRNA-122研究的深入,在肝移植方面,Verhoeven等的研究報告顯示,DCD供肝低溫機械灌注期間,灌注液中miRNA-122水平對供肝缺血損傷有一定評估作用,也有實驗表明,術(shù)后受者血清中miRNA-122水平可早期預(yù)測術(shù)后急性排斥反應(yīng)及缺血性膽道并發(fā)癥,但在DCD供肝獲取過程中,供肝組織中miRNA-122水平與供肝損傷程度及對移植后肝臟功能恢復(fù)預(yù)測方面的研究鮮有報道。目的:本實驗通過建立豬DCD肝臟移植模型,研究DCD供肝組織中miRNA-122表達水平變化與供肝損傷程度及術(shù)后肝功能恢復(fù)情況的相關(guān)性,同時進一步建立合并低氧血癥的DCD肝臟移植模型,研究熱缺血合并缺氧對供肝損傷的影響,以及供肝組織中miRNA-122表達水平對熱缺血合并缺氧所致供肝損傷的評估作用,為DCD供肝損傷評估提供新的監(jiān)測指標及對以后供肝保護提供新的干預(yù)靶點。方法:1、通過“窒息”方法模擬臨床Maastricht III型DCD肝移植過程,建立豬DCD肝臟移植模型,在不同熱缺血時間點(缺血0分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘)留取新鮮肝臟組織及病理制片所需肝臟組織。2、建立合并低氧血癥的豬DCD肝臟移植模型,在不同缺氧處理時間點(缺氧15分鐘、30分鐘、60分鐘)及缺氧合并熱缺血時間點(缺氧15分鐘、30分鐘、60分鐘合并熱缺血20分鐘)留取新鮮肝臟組織及病理制片所需肝臟組織。3、提取肝臟組織中總miRNA,采用qRT-PCR方法測定不同時間點肝臟組織中miRNA-122表達水平,監(jiān)測肝臟移植后不同時間點(移植術(shù)后1小時、3小時、6小時、12小時、24小時)血清酶學(xué)變化及總膽汁量情況。4、以多樣本方差分析方法比較各監(jiān)測指標隨肝臟缺氧及熱缺血時間變化有無統(tǒng)計學(xué)差異,以柱狀圖表示各監(jiān)測指標隨時間變化趨勢。結(jié)果:1、在豬DCD肝移植模型中,熱缺血10分鐘時,供肝組織病理學(xué)并沒有明顯改變,但供肝組織中miRNA-122表達水平已先于供肝組織病理改變出現(xiàn)異常升高。2、隨著熱缺血時間延長,供肝病組織病理學(xué)開始出現(xiàn)改變,組織中miRNA-122表達水平也有逐漸升高趨勢,供肝組織中miRNA-122表達水平在不同缺血時間組之間有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),移植術(shù)后不同時間點肝功能指標在各組間有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。3、單純?nèi)毖跆幚?5分鐘、30分鐘、60分鐘對供肝組織病理基本無影響,但供肝組織中miRNA-122表達水平在缺氧處理60分鐘時開始明顯升高,且與缺氧處理15分鐘及30分鐘組有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。4、在不同缺氧合并缺血處理組,供肝組織中miRNA-122表達水平隨缺氧處理時間延長有升高趨勢,組間有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),移植術(shù)后不同時間點肝功能指標在各組間有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:1、“窒息”法建立豬DCD移植模型具有相對安全、可控性強等優(yōu)點,可以很好地模擬臨床Maastricht III型DCD肝臟移植過程。2、供肝組織中miRNA-122表達水平在熱缺血10分鐘時開始升高,先于供肝組織病理改變,且隨缺血時間延長繼續(xù)升高,miRNA-122水平可以反映供肝熱缺血損傷情況,同時供肝組織中miRNA-122水平與術(shù)后肝功能指標變化有一定相關(guān)性,可以作為供肝熱缺血損傷的一個評估指標。3、供肝組織中miRNA-122表達水平在缺氧處理60分鐘時明顯升高,供肝組織中miRNA-122水平可以反映缺氧對供肝的損傷,可以作為供肝缺氧血損傷的一個評估指標。4、供肝組織中miRNA-122水平對供肝缺氧合并熱缺血損傷有良好的評估作用。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R657.3
【圖文】：

C D圖 1 豬肝移植過程圖A、肝臟低溫保存及修整；B、肝上下腔靜脈吻合；C、門靜脈吻合完畢；D、肝下下腔靜脈完畢，各吻合口不狹窄、不漏血。2.2.2 實驗動物分組DCD 實驗動物共 18 頭，隨機分為 3 組，熱缺血時間分別為 10 分鐘、20 分鐘30 分鐘。2.2.3 標本留取及指標測定（1）開腹后留取肝臟組織，作為對照，不同熱缺血時間組留取對應(yīng)時間點（缺血10分鐘、20分鐘、30分鐘）肝臟組織，留取肝臟移植后1小時、3小時、6小時12小時、24小時肝臟組織標本、血清標本及術(shù)后24小時總膽汁量。

C D圖 2 不同熱缺血時間肝臟組織病理學(xué) HE 染色（×200）A 正常肝臟 B 熱缺血 10min C 熱缺血 20min D 熱缺血 30min3.1.2 移植后肝臟病理學(xué)改變熱缺血 20 分鐘組，移植后 1 小時，肝細胞形態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在部分胞出現(xiàn)水腫，個別細胞有壞死現(xiàn)象；隨著術(shù)后時間延長，肝細胞水腫明顯加重胞核開始碎裂，移植后 24h 時，明顯出現(xiàn)細胞碎裂，細胞壞死。見圖 3

11E圖 3 移植后肝臟組織病理學(xué) HE 染色（×200）A 移植后 1h B 移植后 3h C 移植后 6h D 移植后 12h E 移植后 24h3.2 不同熱缺血時間組供肝組織中 miRNA-122 表達水平qRT-PCR 半定量分析，肝臟組織中 miRNA-122 相對表達水平在熱缺血 10 分時已有升高，且隨著熱缺血時間延長，表達量有逐漸升高趨勢，各組之間均有統(tǒng)學(xué)差異。見圖 4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 莊鵬;李志瑩;王湘郴;鄭昌京;;肝特異性的miR-122對肝癌細胞增殖及凋亡的影響[J];中國免疫學(xué)雜志;2013年07期

本文編號：2782359