【摘要】：前言肝臟移植是治療終末期肝病最有效的手段,但供肝來(lái)源短缺與等待肝臟移植患者數(shù)量之間的矛盾仍是目前全球器官移植面對(duì)的難題,國(guó)外20世紀(jì)60年代開(kāi)始利用心臟循環(huán)死亡后器官捐獻(xiàn)(Donation after Cardio-circulatory Death,DCD)供體,之后被腦死亡后器官捐獻(xiàn)(Donation after Brain Death,DBD)供體所取代,直到20世紀(jì)80年代,歐美移植中心重新關(guān)注DCD供體。與DBD供體相比,DCD供肝術(shù)后發(fā)生移植物原發(fā)性無(wú)功能(primary non-function,PNF)、肝動(dòng)脈血栓形成(hepatic artery thrombosis,HAT)等嚴(yán)重并發(fā)癥機(jī)會(huì)明顯增加,這與在心臟停跳過(guò)程中發(fā)生復(fù)雜缺血、缺氧條件所導(dǎo)致的熱損傷明顯相關(guān)。因此對(duì)于DCD供肝的質(zhì)量評(píng)估顯的尤為重要,以避免放棄可用供肝造成的器官浪費(fèi),以及應(yīng)用不適合供肝造成嚴(yán)重不良后果。目前對(duì)DCD供肝質(zhì)量評(píng)估方式主要有冷-熱缺血時(shí)間、脂肪肝程度、供者血鈉水平、年齡、肝炎感染、腫瘤等方面,仍沒(méi)有一種客觀反映供肝損傷程度及預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo),因此,尋找一種敏感、客觀的評(píng)估指標(biāo)是目前DCD肝臟移植面臨的一個(gè)嚴(yán)峻問(wèn)題。miRNA-122是miRNA家族的一員,約占肝臟細(xì)胞中總miRNA的70%,且在其他組織中檢測(cè)不到,胚胎時(shí)期,肝臟細(xì)胞中miRNA-122水平開(kāi)始升高,在成年鼠肝臟中,每個(gè)細(xì)胞中含量可達(dá)到66000拷貝,人的肝細(xì)胞中可達(dá)到135000拷貝,miRNA-122序列從人到斑馬魚(yú)都是高度保守的,而且斑馬魚(yú)的原位雜交也說(shuō)明miRNA-122肝臟特異性也是高度保守的。miRNA-122參與肝臟的發(fā)育分化、基因表達(dá)調(diào)控和功能代謝,研究表明其與非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝細(xì)胞癌、藥物性肝損傷均有明顯相關(guān)性,近年來(lái)隨著對(duì)miRNA-122研究的深入,在肝移植方面,Verhoeven等的研究報(bào)告顯示,DCD供肝低溫機(jī)械灌注期間,灌注液中miRNA-122水平對(duì)供肝缺血損傷有一定評(píng)估作用,也有實(shí)驗(yàn)表明,術(shù)后受者血清中miRNA-122水平可早期預(yù)測(cè)術(shù)后急性排斥反應(yīng)及缺血性膽道并發(fā)癥,但在DCD供肝獲取過(guò)程中,供肝組織中miRNA-122水平與供肝損傷程度及對(duì)移植后肝臟功能恢復(fù)預(yù)測(cè)方面的研究鮮有報(bào)道。目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立豬DCD肝臟移植模型,研究DCD供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平變化與供肝損傷程度及術(shù)后肝功能恢復(fù)情況的相關(guān)性,同時(shí)進(jìn)一步建立合并低氧血癥的DCD肝臟移植模型,研究熱缺血合并缺氧對(duì)供肝損傷的影響,以及供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平對(duì)熱缺血合并缺氧所致供肝損傷的評(píng)估作用,為DCD供肝損傷評(píng)估提供新的監(jiān)測(cè)指標(biāo)及對(duì)以后供肝保護(hù)提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。方法:1、通過(guò)“窒息”方法模擬臨床Maastricht III型DCD肝移植過(guò)程,建立豬DCD肝臟移植模型,在不同熱缺血時(shí)間點(diǎn)(缺血0分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘)留取新鮮肝臟組織及病理制片所需肝臟組織。2、建立合并低氧血癥的豬DCD肝臟移植模型,在不同缺氧處理時(shí)間點(diǎn)(缺氧15分鐘、30分鐘、60分鐘)及缺氧合并熱缺血時(shí)間點(diǎn)(缺氧15分鐘、30分鐘、60分鐘合并熱缺血20分鐘)留取新鮮肝臟組織及病理制片所需肝臟組織。3、提取肝臟組織中總miRNA,采用qRT-PCR方法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)肝臟組織中miRNA-122表達(dá)水平,監(jiān)測(cè)肝臟移植后不同時(shí)間點(diǎn)(移植術(shù)后1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí))血清酶學(xué)變化及總膽汁量情況。4、以多樣本方差分析方法比較各監(jiān)測(cè)指標(biāo)隨肝臟缺氧及熱缺血時(shí)間變化有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以柱狀圖表示各監(jiān)測(cè)指標(biāo)隨時(shí)間變化趨勢(shì)。結(jié)果:1、在豬DCD肝移植模型中,熱缺血10分鐘時(shí),供肝組織病理學(xué)并沒(méi)有明顯改變,但供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平已先于供肝組織病理改變出現(xiàn)異常升高。2、隨著熱缺血時(shí)間延長(zhǎng),供肝病組織病理學(xué)開(kāi)始出現(xiàn)改變,組織中miRNA-122表達(dá)水平也有逐漸升高趨勢(shì),供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平在不同缺血時(shí)間組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝功能指標(biāo)在各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3、單純?nèi)毖跆幚?5分鐘、30分鐘、60分鐘對(duì)供肝組織病理基本無(wú)影響,但供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平在缺氧處理60分鐘時(shí)開(kāi)始明顯升高,且與缺氧處理15分鐘及30分鐘組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。4、在不同缺氧合并缺血處理組,供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平隨缺氧處理時(shí)間延長(zhǎng)有升高趨勢(shì),組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝功能指標(biāo)在各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:1、“窒息”法建立豬DCD移植模型具有相對(duì)安全、可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可以很好地模擬臨床Maastricht III型DCD肝臟移植過(guò)程。2、供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平在熱缺血10分鐘時(shí)開(kāi)始升高,先于供肝組織病理改變,且隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)繼續(xù)升高,miRNA-122水平可以反映供肝熱缺血損傷情況,同時(shí)供肝組織中miRNA-122水平與術(shù)后肝功能指標(biāo)變化有一定相關(guān)性,可以作為供肝熱缺血損傷的一個(gè)評(píng)估指標(biāo)。3、供肝組織中miRNA-122表達(dá)水平在缺氧處理60分鐘時(shí)明顯升高,供肝組織中miRNA-122水平可以反映缺氧對(duì)供肝的損傷,可以作為供肝缺氧血損傷的一個(gè)評(píng)估指標(biāo)。4、供肝組織中miRNA-122水平對(duì)供肝缺氧合并熱缺血損傷有良好的評(píng)估作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R657.3
【圖文】：

C D圖 1 豬肝移植過(guò)程圖A、肝臟低溫保存及修整；B、肝上下腔靜脈吻合；C、門(mén)靜脈吻合完畢；D、肝下下腔靜脈完畢，各吻合口不狹窄、不漏血。2.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組DCD 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共 18 頭，隨機(jī)分為 3 組，熱缺血時(shí)間分別為 10 分鐘、20 分鐘30 分鐘。2.2.3 標(biāo)本留取及指標(biāo)測(cè)定（1）開(kāi)腹后留取肝臟組織，作為對(duì)照，不同熱缺血時(shí)間組留取對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（缺血10分鐘、20分鐘、30分鐘）肝臟組織，留取肝臟移植后1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)12小時(shí)、24小時(shí)肝臟組織標(biāo)本、血清標(biāo)本及術(shù)后24小時(shí)總膽汁量。

C D圖 2 不同熱缺血時(shí)間肝臟組織病理學(xué) HE 染色（×200）A 正常肝臟 B 熱缺血 10min C 熱缺血 20min D 熱缺血 30min3.1.2 移植后肝臟病理學(xué)改變熱缺血 20 分鐘組，移植后 1 小時(shí)，肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在部分胞出現(xiàn)水腫，個(gè)別細(xì)胞有壞死現(xiàn)象；隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，肝細(xì)胞水腫明顯加重胞核開(kāi)始碎裂，移植后 24h 時(shí)，明顯出現(xiàn)細(xì)胞碎裂，細(xì)胞壞死。見(jiàn)圖 3

11E圖 3 移植后肝臟組織病理學(xué) HE 染色（×200）A 移植后 1h B 移植后 3h C 移植后 6h D 移植后 12h E 移植后 24h3.2 不同熱缺血時(shí)間組供肝組織中 miRNA-122 表達(dá)水平qRT-PCR 半定量分析，肝臟組織中 miRNA-122 相對(duì)表達(dá)水平在熱缺血 10 分時(shí)已有升高，且隨著熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量有逐漸升高趨勢(shì)，各組之間均有統(tǒng)學(xué)差異。見(jiàn)圖 4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 莊鵬;李志瑩;王湘郴;鄭昌京;;肝特異性的miR-122對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2013年07期

本文編號(hào)：2782359