發(fā)布時間：2020-07-27 08:31

【摘要】：目的DMSO在臨床及科研中被廣泛應(yīng)用,但其對于細(xì)胞的影響常被忽略。本研究旨在檢測低濃度DMSO對RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞破骨分化的影響,降低DMSO的使用濃度,為低濃度DMSO在臨床及科研中的使用提供實驗依據(jù)。方法1細(xì)胞增殖檢測:細(xì)胞接種在96孔板上,50ng/ml RANKL誘導(dǎo)24小時后,RANKL誘導(dǎo)液中分別加入0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八種低濃度的DMSO繼續(xù)培養(yǎng),DMSO作用第1,3,5,7,9天時,檢測各組細(xì)胞數(shù)。2 TRAP活性檢測:細(xì)胞接種在96孔板上,50ng/ml RANKL誘導(dǎo)細(xì)胞24小時后,采用0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八種低濃度的DMSO誘導(dǎo)培養(yǎng)4天后,按照TRAP活性檢測試劑盒使用說明,酶標(biāo)儀檢測各組吸光光度值,用BCA蛋白試劑盒檢測各組蛋白濃度,各組吸光光度值與蛋白濃度的比值即為TRAP活性值。3 TRAP染色及形態(tài)學(xué)分析:細(xì)胞接種在48孔板上,50ng/ml RANKL誘導(dǎo)細(xì)胞24小時后,以0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八種低濃度的DMSO作用于細(xì)胞4天后,按TRAP染色試劑盒使用說明進行TRAP染色。室溫晾干,光學(xué)顯微鏡收集各組影像,每組隨機拍攝20張照片,使用Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行測量,記錄每張照片中RAW264.7細(xì)胞TRAP染色陽性的細(xì)胞總數(shù),總面積及單個細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核個數(shù)。4破骨分化相關(guān)基因表達(dá)檢測:細(xì)胞接種于6孔板,采用0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八種低濃度的DMSO和RANKL聯(lián)合刺激培養(yǎng)4天后,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,然后根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒使用說明進行實時熒光定量PCR檢測。5鈣鹽吸收能力檢測:細(xì)胞接種于底部為磷酸鹽涂層的破骨細(xì)胞分析基質(zhì)板(OAAS板),采用0,0.001%,0.005%,0.01%,0.05%,0.1%,0.15%,0.2%八種低濃度的DMSO作用于經(jīng)50ng/ml RANKL誘導(dǎo)24小時后的細(xì)胞,聯(lián)合刺激培養(yǎng)10天,觀察OAAS板上的鈣鹽吸收陷窩,室溫下晾干,光學(xué)顯微鏡隨機收集各組照片,使用ImagePro Plus 6.0軟件對每張照片中鈣鹽吸收陷窩面積進行測量。結(jié)果1細(xì)胞增殖:第1天,各組間細(xì)胞數(shù)相近,無顯著差異(P0.05);第3天,所有DMSO與RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)刺激組的細(xì)胞數(shù)均為RANKL單獨誘導(dǎo)組細(xì)胞數(shù)的1.5倍以上,各組與RANKL單獨誘導(dǎo)組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);第5天,與單獨RANKL誘導(dǎo)組相比,0.001%DMSO組細(xì)胞數(shù)顯著增多(P0.01),0.005%DMSO和0.01%DMSO對細(xì)胞增殖的促進作用有所減弱,0.2%濃度DMSO對細(xì)胞增殖的促進作用最強;第7天,各組細(xì)胞均明顯增殖,各組增殖趨勢與第5天大致相同;第9天,各組細(xì)胞數(shù)較第7天均有增長,0.1%DMSO組細(xì)胞數(shù)最高,但與其它各組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而RANKL單獨應(yīng)用組與RANKL與DMSO聯(lián)合應(yīng)用組組間亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)2 TRAP活性:各濃度DMSO組與RANKL聯(lián)合應(yīng)用組較RANKL單獨誘導(dǎo)組TRAP活性均有所下降,且表現(xiàn)為隨DMSO濃度增高TRAP活性下降的趨勢,且各DMSO作用組均與單純RANKL誘導(dǎo)組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。3 TRAP染色與形態(tài)學(xué)分析:1)破骨細(xì)胞總面積:較RANKL單獨誘導(dǎo)組相比,DMSO濃度為0.005%和0.01%時,RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的總面積均顯著增大(P0.01),DMSO濃度為0.005%時破骨細(xì)胞總面積達(dá)峰值;隨DMSO濃度進一步提高為0.1%,0.15%,0.2%時,破骨細(xì)胞總面積隨濃度升高而減小;DMSO濃度為0.001%,0.05%,0.1%時,破骨細(xì)胞總面積與未加DMSO組無顯著性差別(P0.05),DMSO濃度為0.15%,0.2%時破骨細(xì)胞總面積均顯著低于單獨RANKL誘導(dǎo)組(P0.01)。2)破骨細(xì)胞數(shù):單個培養(yǎng)孔內(nèi),與RANKL單獨誘導(dǎo)組相比,0.001%DMSO組破骨細(xì)胞數(shù)量多于RANKL單獨誘導(dǎo)組,且DMSO作用組均與單獨RANKL誘導(dǎo)組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。DMSO濃度為0.05%、0.1%、0.15%時,破骨細(xì)胞數(shù)量與RANKL單獨誘導(dǎo)組相比均顯著增加(P0.01)。0.2%DMSO組較RANKL單獨誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞數(shù)量有所增加,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3)破骨細(xì)胞平均面積:與單純RANKL誘導(dǎo)組相比,DMSO濃度為0.005%和0.01%時,破骨細(xì)胞平均面積顯著增大(P0.01),且0.05%與0.01%兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),隨著DMSO濃度進一步提高為0.05%,0.1%,0.15%和0.2%時,破骨細(xì)胞平均面積隨濃度升高而減小,與RANKL單獨誘導(dǎo)組均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。4)各組破骨細(xì)胞細(xì)胞核數(shù):與RANKL單獨誘導(dǎo)組相比,DMSO濃度為0.001%時單個破骨細(xì)胞所包含的細(xì)胞核數(shù)少于3個的細(xì)胞數(shù)最少,DMSO濃度為0.15%時單個破骨細(xì)胞所包含的細(xì)胞核數(shù)少于3個的細(xì)胞數(shù)最多,兩組均與RANKL單獨誘導(dǎo)組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);與RANKL單獨誘導(dǎo)組相比,DMSO濃度為0.005%時單個破骨細(xì)胞所包含的細(xì)胞核數(shù)在3到20個的細(xì)胞數(shù)最少,DMSO濃度為0.1%時單個破骨細(xì)胞所包含的細(xì)胞核數(shù)在3到20個的細(xì)胞數(shù)最多,兩組均與RANKL單獨誘導(dǎo)組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01);與RANKL單獨誘導(dǎo)組相比,DMSO濃度為0.005%時單個破骨細(xì)胞所包含的細(xì)胞核數(shù)多于20個的細(xì)胞數(shù)最多,DMSO濃度為0.2%時單個破骨細(xì)胞所包含的細(xì)胞核數(shù)多于20個的細(xì)胞數(shù)最少,兩組均與RANKL單獨誘導(dǎo)組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。4破骨分化相關(guān)基因表達(dá):1)Acp5基因:與RANKL單純誘導(dǎo)組相比,除0.001%DMSO組促進了Acp5基因表達(dá),其余濃度DMSO組均抑制了Acp5基因表達(dá)。2)Calcr基因:0.001%DMSO和0.01%DMSO組均促進了Calcr基因表達(dá),但與RANKL單純誘導(dǎo)組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),其余濃度DMSO組均抑制了Calcr基因表達(dá)。3)Ctsk基因:與RANKL單純誘導(dǎo)組相比,除0.001%DMSO組促進Ctsk基因表達(dá),其余濃度DMSO組均抑制了Ctsk基因表達(dá)。5鈣鹽吸收能力檢測:較RANKL單獨應(yīng)用組相比,0.001%DSMO組所形成的鈣鹽吸收陷窩面積顯著增大(P0.01),0.005%DMSO組所形成的鈣鹽吸收陷窩面積大于RANKL單獨應(yīng)用組,但已無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),隨著DMSO濃度升高,鈣鹽吸收面積呈逐漸減少的趨勢,并在0.2%DMSO組達(dá)到最小值。結(jié)論1 DMSO具有促進破骨細(xì)胞增殖的作用,并隨濃度增高抑制TRAP活性及破骨相關(guān)基因表達(dá)。2破骨細(xì)胞表面積隨DMSO濃度升高表現(xiàn)為鐘形曲線,DMSO濃度為0.005%和0.01%時較單純RANKL誘導(dǎo)組表現(xiàn)為促進作用,但隨DMSO濃度升高,逐漸轉(zhuǎn)為抑制作用。3破骨細(xì)胞TRAP活性的高低,TRAP染色陽性細(xì)胞面積的大小并不能夠直接等同于這類細(xì)胞鈣鹽吸收能力以及骨吸收能力的強弱。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R68
【圖文】：

實驗結(jié)果均使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，不同濃度 DMSO 組間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析（ANOVA）,各組數(shù)值為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）,定義 P<0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異。1.3 實驗結(jié)果1.3.1 RAW264.7 細(xì)胞倒置相差顯微鏡鏡下觀察RAW264.7 細(xì)胞(圖 2)復(fù)蘇及接種后，表現(xiàn)為未貼壁的漂浮狀態(tài)。長勢狀態(tài)良好的 RAW264.7 細(xì)胞在孵育箱中培養(yǎng) 1-2 小時左右后可貼壁，2 小時后細(xì)胞貼壁率可達(dá)到總數(shù)的 80%-90%。此時可在鏡下觀察其形態(tài)，RAW264.7 細(xì)胞呈圓形或卵圓形，透明度較好，胞質(zhì)明確，界限清晰并呈散在分布，細(xì)胞體積較小且形態(tài)較單一，故分化現(xiàn)象不明顯。在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，可通過顯微鏡觀察其增殖速度及融合密度，鏡下觀察細(xì)胞融合率 80%以上時，可進行傳代。

同濃度 RANKL 誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞破骨分化 TRAP 染色別采用 10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml 以及 100ng/ml RANKL 誘導(dǎo) 天后，使用光學(xué)顯微鏡鏡下觀察 RANKL 誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞 TTRAP 染色陽性的破骨細(xì)胞如圖 5 所示。 10ng/ml RANKL 誘導(dǎo)的細(xì)胞鏡下可見極少的多核樣細(xì)胞，經(jīng) 誘導(dǎo)細(xì)胞雖然可見部分 TRAP 染色陽性的破骨細(xì)胞，但數(shù)量少，能構(gòu)建理想的破骨細(xì)胞分化模型。而經(jīng) 50ng/ml 和 100ng/ml RAN4.7 細(xì)胞均有較多 TRAP 染色陽性的成熟破骨細(xì)胞出現(xiàn)，表現(xiàn)為多用于檢測不同濃度 DMSO 對 RAW264.7 細(xì)胞破骨分化的影響，使s 6.0 軟件對各濃度 RANKL 誘導(dǎo)的 RAW264.7 細(xì)胞破骨總面積和行定量分析，結(jié)果如圖 3，圖 4 所示，由于 50ng/ml 和 100ng/ml R分化的能力相近，因此采用 50ng/ml RANKL 誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)

圖 4 不同濃度 RANKL 誘導(dǎo) RAW264.7 破骨細(xì)胞總數(shù)（**P<0.01，*P<0.05，n=3）.4 The total number of osteoclast induced by different concentration of RA（**P<0.01，*P<0.05，n=3）

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本文編號：2771602