【摘要】：背景脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,主要臨床表現(xiàn)為損傷平面以下的感覺、運(yùn)動(dòng)功能完全喪失及大小便失禁,其發(fā)病率以及致殘率正逐年升高,給患者家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān),目前尚沒有行之有效的治療方法。干細(xì)胞具有自我更新、高度增殖的特點(diǎn)以及多向分化潛能,因此干細(xì)胞替代療法成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的新起點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)由于其取材方便、無免疫原性且無倫理問題,廣泛用于干細(xì)胞替代療法。但移植干細(xì)胞治療中樞神經(jīng)損傷疾病,也普遍存在移植后細(xì)胞存活率低、分化效率低和神經(jīng)痛發(fā)生率高等缺點(diǎn)。表觀遺傳調(diào)控是一種以染色質(zhì)為基礎(chǔ)的基因表達(dá)調(diào)控手段,其中較為廣泛的一類研究是組蛋白乙�；�。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙�；脚c多種神經(jīng)疾病相關(guān),組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitor,HDACi)能促進(jìn)干細(xì)胞成神經(jīng)分化,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)HDACi能激活SDF1/CXCR4反應(yīng)軸,促進(jìn)干細(xì)胞向病灶部位遷移,同時(shí)HDACi可以使Nrf2乙�；�,激活Nrf2/ARE通路,有效減輕損傷后的炎癥反應(yīng)。曲古霉素A(trichostatin A,TSA)是一種穩(wěn)定且高效的HDACi,關(guān)于TSA聯(lián)合BMSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后是否具有神經(jīng)保護(hù)功能的研究尚未見報(bào)道。本研究以此為背景,探究TSA聯(lián)合BMSCs治療對(duì)SCI小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。目的體外實(shí)驗(yàn)檢測TSA對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞(hippocampal neuronal cell line,HT22)氧化損傷的保護(hù)作用;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究TSA聯(lián)合BMSCs對(duì)SCI小鼠神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法第一部分:TSA對(duì)HT22細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(NC組),H_2O_2損傷組和TSA+H_2O_2治療組三組:1.CCK-8法檢測細(xì)胞活力建立HT22細(xì)胞氧化損傷模型以及確定TSA的最適添加濃度;2.流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡情況,Transwell檢測細(xì)胞遷移能力;3.ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中SOD和MDA表達(dá)情況,ROS試劑盒檢測細(xì)胞中ROS的含量。第二部分:TSA聯(lián)合BMSCs對(duì)SCI小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究采用改良小鼠Allen’s法擊打T10節(jié)段制備小鼠SCI模型,將小鼠隨機(jī)分為生理鹽水處理組(Vehicle組,Veh組)、TSA組、BMSCs移植組和TSA+BMSCs聯(lián)合治療組(N=127):1.采用BMS評(píng)分(Basso Mouse Scale)和斜面放置試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)狀況,懸尾試驗(yàn)和糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的抑郁情況;2.CV染色檢測損傷體積,干濕稱重法檢測小鼠損傷部位的脊髓水含量評(píng)價(jià)脊髓水腫;3.qRT-PCR檢測神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT3和NGF以及神經(jīng)元分化相關(guān)因子DCX、MAP2和NSE的表達(dá)量,免疫熒光染色檢測脊髓損傷部位GFAP、MBP和NeuN的表達(dá);4.ELISA試劑盒檢測炎癥相關(guān)因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)情況,二氫乙錠(Het)染色檢測損傷部位活性氧的表達(dá),PI染色檢測小鼠損傷部位壞死細(xì)胞數(shù)量,TUNEL試劑盒檢測損傷部位壞死細(xì)胞的數(shù)量;5.Western blot檢測Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果第一部分:TSA對(duì)HT22細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用1.與H_2O_2組比較,TSA能減輕H_2O_2氧化損傷導(dǎo)致的HT22細(xì)胞活力降低,減少凋亡,促進(jìn)遷移(P0.05);2.與H_2O_2組比較,TSA處理組SOD活力明顯升高,MDA水平降低,體內(nèi)ROS的積累減少,TSA治療能明顯減輕其導(dǎo)致的氧化損傷(P0.05)。第二部分:TSA聯(lián)合BMSCs對(duì)SCI小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究1.TSA+BMSCs聯(lián)合治療明顯改善小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能和情緒狀況,降低損傷體積,增加體重并減少脊髓含水量(P0.05);2.TSA+BMSCs治療增加神經(jīng)分化和神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)因子的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng),減少GFAP的表達(dá),減少了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,同時(shí)降低活性氧的表達(dá)(P0.05);3.TSA+BMSCs治療增加了NeuN的表達(dá),增加存活神經(jīng)元數(shù)量,MBP面積增加,減少了白質(zhì)損傷,同時(shí)降低損傷部位壞死和凋亡細(xì)胞數(shù)量(P0.05);4.Western blot結(jié)果顯示TSA能增加Nrf2的表達(dá),降低Keap1的表達(dá),同時(shí)增加其下游蛋白SOD1和NQO1的表達(dá),表明TSA能激活Nrf2/ARE通路(P0.05)。結(jié)論1.TSA治療能減輕H_2O_2導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷;2.TSA聯(lián)合BMSCs通過激活Nrf2/ARE通路和減少ROS的積累,減輕SCI小鼠病灶部位的炎癥反應(yīng)和氧化損傷,減少細(xì)胞壞死和凋亡,起到神經(jīng)保護(hù)的作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R651.2
【圖文】：

H2O2損傷后細(xì)胞存活率和TSA對(duì)損傷HT22細(xì)胞活力的影響

流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞凋亡率

Transwell小室觀察各組HT22細(xì)胞的遷移(200×)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Effect of valproic acid on endogenous neural stem cell proliferation in a rat model of spinal cord injury[J];Neural Regeneration Research;2009年07期

本文編號(hào)：2771532