【摘要】：目的研究負(fù)壓傷口療法(negative pressure wound therapy,NPWT)對(duì)小鼠燒傷感染創(chuàng)面愈合的作用,并基于全轉(zhuǎn)錄測(cè)序探討其潛在相關(guān)作用的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1)構(gòu)建小鼠背部燙傷感染創(chuàng)面模型,并隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組,24h后行切痂術(shù),NPWT組創(chuàng)面使用聚氨酯泡沫敷料覆蓋創(chuàng)面并生物半透膜封閉、連接負(fù)壓吸引,對(duì)照組聚氨酯泡沫敷料覆蓋創(chuàng)面并生物半透膜封閉,不連接負(fù)壓。觀察指標(biāo)如下:(1)觀察記錄小鼠創(chuàng)面感染和愈合狀況;(2)采用多普勒血流儀檢測(cè)第1、3、5、7天創(chuàng)面血流情況;(3)取第1、3、5、7天小鼠創(chuàng)緣組織切片,HE染色觀察小鼠創(chuàng)緣組織病理變化,免疫組化觀察CD31、Ki67、VEGF和TGF-β1表達(dá)變化;(4)ELISA檢測(cè)創(chuàng)緣組織中IL-1β、TNF-α、VEGF和TGF-β1含量。2)構(gòu)建在體動(dòng)物模型及隨機(jī)分組方法同前,實(shí)驗(yàn)組給予NPWT治療,對(duì)照組治療同上,于治療24小時(shí)之后收集創(chuàng)緣皮膚組織提取總RNA,檢測(cè)合格后,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析,基本步驟如下:(1)使用Illumina HiseqXten對(duì)樣品上機(jī)測(cè)序,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)全基因組定位、基因結(jié)構(gòu)分析、染色體定位分析以保證結(jié)果可信度,計(jì)算基因表達(dá)量,并篩選NPWT組與對(duì)照組的差異表達(dá)基因。(2)根據(jù)circRNA結(jié)構(gòu)特征,對(duì)樣本中可能存在的circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè),計(jì)算表達(dá)量并篩選差異表達(dá)。(3)根據(jù)mRNA差異基因篩選結(jié)果,用DESeq算法進(jìn)行差異基因篩選(DifGeneFinder),得到差異表達(dá)的lncRNA。(4)從總RNA中分離純化18-30nt的miRNA分別在各miRNA的3’和5’端接頭序列上用T4連接酶連接,然后通過(guò)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增,所得miRNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序分析并篩選差異表達(dá)基因。(5)采用生物信息學(xué)的工具和方法對(duì)NPWT治療后小鼠感染創(chuàng)面組織中差異表達(dá)基因進(jìn)行本體功能分類(lèi)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建、信號(hào)通路分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、互作關(guān)系分析、circRNAs/lncRNAs-miRNAs-mRNAs的靶標(biāo)關(guān)系預(yù)測(cè)分析,篩選出可能在NPWT促進(jìn)創(chuàng)面愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用的circRNAs,lncRNAs,miRNAs和mRNAs并對(duì)分析篩選結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1)在實(shí)驗(yàn)第1、3、5天,NPWT組中標(biāo)記菌熒光表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P0.01);小鼠創(chuàng)面,第3天與對(duì)照組相比NPWT組面積即顯著縮小(P0.05),該差異性至實(shí)驗(yàn)觀察最后時(shí)間點(diǎn)第7天;創(chuàng)面血流,在實(shí)驗(yàn)第3、5、7天,與對(duì)照組相比NPWT組灌注量顯著升高(P0.01)。創(chuàng)面組織HE染色結(jié)果顯示,NPWT組中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與對(duì)照組相比顯著降低(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,NPWT組CD31,Ki67,TGF-β1,VEGF表達(dá)量均顯著增加(P0.05)。ELISA結(jié)果顯示,NPWT組創(chuàng)緣組織中TNF-α水平在傷后1、3、5天均顯著低于對(duì)照組(P0.01);NPWT組中IL-1β的水平在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有顯著變化,對(duì)照組中IL-1β表達(dá)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前3天顯著升高(P0.01);NPWT組創(chuàng)緣組織中VEGF的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)第3天顯著升高(P0.01),并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)第3天后表達(dá)水平逐漸升高,但仍顯著低于NPWT組;TGF-β1表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第1天,NPWT組即顯著高于對(duì)照組(P0.01)并在實(shí)驗(yàn)第3天達(dá)到峰值。上述結(jié)果表明,NPWT能促進(jìn)創(chuàng)面愈合,并能引起廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。2)通過(guò)RNA-seq技術(shù)成功構(gòu)建了各樣本的轉(zhuǎn)錄組,具體分析結(jié)果如下:(1)得到864個(gè)顯著差異mRNAs,其中上調(diào)610個(gè),下調(diào)254個(gè);預(yù)測(cè)到共有37個(gè)顯著差異circRNAs,12個(gè)上調(diào)和25個(gè)下調(diào);108個(gè)顯著表達(dá)差異lncRNAs,68個(gè)上調(diào),39個(gè)下調(diào);67個(gè)具有顯著差異miRNAs,其中37個(gè)上調(diào),30個(gè)下調(diào)。(2)通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出與miRNAs存在關(guān)系的差異顯著的外顯子型circRNAs有5個(gè),與其存在ceRNA關(guān)系的miRNAs有4個(gè),包括mmu-miR-877-3p,mmu-miR-669m-5p,mmu-miR-1224-3p,mmu-miR-497a-5p,它們調(diào)控52個(gè)顯著差異的mRNA。分析顯示這些基因功能集中在免疫反應(yīng)、炎癥應(yīng)答、病毒防御等免疫功能相關(guān)的基因表型。篩選出差異顯著的長(zhǎng)度大于200bp lncRNAs有107個(gè),GO本體分析結(jié)果顯示其與circRNAs的結(jié)果完全一致;而與這些lncRNAs存在ceRNA關(guān)系的miRNAs中有3個(gè)與cricRNAs也存在ceRNA關(guān)系,即mmu-miR-669m-5p,mmu-miR-1224-3p,mmu-miR-497a-5p。故存在功能交集并受到circRNAs和lncRNAs共同調(diào)控的顯著差異基因有44個(gè)mRNAs,綜上所述,經(jīng)生物信息分析,課題組篩選出3個(gè)circRNAs、5個(gè)lncRNAs、3個(gè)miRNAs、44個(gè)mRNAs可能是NPWT促進(jìn)創(chuàng)面愈合中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子,功能集中在免疫反應(yīng)、炎癥應(yīng)答、病毒防御等免疫功能相關(guān)的基因表型。通過(guò)對(duì)上述顯著差異的cricRNAs、lncRNAs、miRNAs和mRNAs等分子的表達(dá)情況進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,并對(duì)mRNAs編碼的蛋白進(jìn)行western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。qPCR驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序檢測(cè)結(jié)果一致,western blotting驗(yàn)證,確定TIFA、GLA、PLCB2、CD84及SLFN9等分子在實(shí)驗(yàn)組中出現(xiàn)顯著上調(diào),這與測(cè)序檢測(cè)結(jié)果基本一致。結(jié)論1.燒傷感染創(chuàng)面可引起小鼠創(chuàng)面局部組織中細(xì)菌增殖,炎性反應(yīng)增高,血流灌注降低,阻礙創(chuàng)面愈合,NPWT治療可減輕創(chuàng)面局部感染,增加血流灌注,抑制抗炎因子表達(dá),促進(jìn)生長(zhǎng)因子表達(dá),加速創(chuàng)面愈合進(jìn)程。2.應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),在構(gòu)建小鼠轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜基礎(chǔ)上,通過(guò)生物信息分析發(fā)現(xiàn),NPWT可能是通過(guò)mmu_circ_0004796,mmu_circ_0011322,mmu_circRNA_Hnrnpll,LOC102634528,LOC102639837,LOC102639918,4930431P03Rik,Gm10782調(diào)控mmu-miR-669m-5p,miR-1224-3p和miR-497a-5p繼而影響TIFA,GLA,CD300a,PLCB2,EIF2AK2,CD84,SLFN9,Lasp1,GDF11等的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R644
【圖文】：

1 細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的傳遞（B r C. Circulation, 2016, 134(19): 1484-1499.）NA 是一種高度保守的、內(nèi)生性的 ncRNA 分子，在各類(lèi)真核生物中類(lèi)短鏈、非編碼的 RNA，無(wú)開(kāi)放閱讀框（ORF）。它們的長(zhǎng)度一般只單位，3’端可有 1-2nt 的長(zhǎng)度變化[52]。成熟的 miRNA 有５’端磷酸這使其有別于其他寡核苷酸及功能 RNA 降解片段[53,54]。最近的一些A 在許多病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中包括細(xì)胞信號(hào)通路的們主要通過(guò)與目標(biāo) mRNA 結(jié)合，調(diào)節(jié) mRNA 的降解或抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程基因的表達(dá)[55]。這些 ncRNA 都是臨床相關(guān)疾患潛在的基因治療靶點(diǎn)物，對(duì)于將來(lái)相關(guān)疾病的診治具有重要意義。的一些研究證實(shí)，miRNA 在皮膚的多種細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)節(jié)過(guò)程中其中包括皮膚干細(xì)胞、免疫細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞[56]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小充質(zhì)干細(xì)胞中，miR-27b 是皮膚干細(xì)胞的一種特異性指標(biāo)。miR-27

表 1 NPWT VS Control 組小鼠創(chuàng)面愈合率 ( % , x ±S )分組 動(dòng)物數(shù)創(chuàng)面愈合率（%）Day1 Day3 Day5 Day7NPWT 15 1.5 ±0.4 15.9 ±6.3* 24.5 ±5.9* 38.8 ±5.5*Control 15 1.4 ±0.5 8.7 ±2.8 16.7 ±3.6 24.3 ±3.8注：NPWT VS Control 創(chuàng)面愈合率比較，*P ＜ 0.054.2 創(chuàng)面標(biāo)記細(xì)菌熒光強(qiáng)度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第 1 d，兩組間創(chuàng)面標(biāo)記菌表達(dá)沒(méi)有顯著差異 ( P ＞0.05 )。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第 3d ，NPWT 組中熒光表達(dá)顯著降低，而對(duì)照組中熒光表達(dá)顯著升高（P ＜0.01），并在實(shí)驗(yàn)第 3 d 達(dá)到峰值。在實(shí)驗(yàn)的第 3、5 d，NPWT 組的熒光表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P ＜ 0.01）。見(jiàn)圖 2。

2 NPWT VS Control 小鼠背部血流灌注對(duì)比 *P ＜ 0.014.4 ELISA 測(cè)定創(chuàng)緣組織中 TNF-α 和 IL-1β 的含量變化如圖 4 所示，創(chuàng)緣組織中 TNF-α 和 IL-1β 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。對(duì)照組中 TNF-α 在實(shí)驗(yàn)第 2 d 即快速升高，在實(shí)驗(yàn)第 3 d 達(dá)到峰值；NPW組中 TNF-α 在第 2 d 顯著升高，但顯著低于對(duì)照組（P ＜ 0.01）且在實(shí)驗(yàn)第 2 天即開(kāi)始回落，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期的前 5 d ，NPWT 組中 TNF-α 含量均顯著低于對(duì)照組（P ＜ 0.01）。NPWT 組中 IL-1β 的水平在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有顯著變化，對(duì)照組中 IL-1表達(dá)在實(shí)驗(yàn)第 3 d 顯著升高（P ＜ 0.01）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 馬戰(zhàn)軍;漆白文;喻愛(ài)喜;;負(fù)壓環(huán)境促進(jìn)血管生成和血管成熟的研究[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2016年05期

2 楊帆;胡

本文編號(hào)：2771467