發(fā)布時(shí)間：2020-07-26 08:56

【摘要】：背景和目的由于先天性畸形導(dǎo)致外觀上的不對(duì)稱,外傷或是手術(shù)后的軟組織缺損或容量減少的現(xiàn)象一直是修復(fù)重建外科學(xué)中所面臨的重大挑戰(zhàn)。脂肪移植作為自體來(lái)源的移植物,其獲取較容易、操作簡(jiǎn)單,因富含成人干細(xì)胞,脂肪不僅有填充作用,還可以改善缺血組織的存活與再生,近年來(lái)逐漸成為一種重要的軟組織修復(fù)工具。盡管脂肪移植后效果顯著長(zhǎng)期觀察移植后的脂肪移植物可能出現(xiàn)高吸收率,甚至是油囊、纖維化等并發(fā)癥。近年有學(xué)者在臨床研究中提出婦女的年齡(大于或小于45歲)是脂肪抽吸物中脂肪細(xì)胞存活的差異點(diǎn);在動(dòng)物模型中,降低雌激素可干擾脂肪移植物保留。目前,雌激素水平對(duì)于脂肪移植的保留率影響仍不明確。因此,我們分別模擬絕經(jīng)前期(CON組,正常雌激素)、絕經(jīng)期(OVX組,低雌激素)及孕期(HE組,高雌激素)來(lái)探討雌激素對(duì)脂肪移植物的存活的影響及免疫調(diào)控機(jī)制。方法1.不同雌激素濃度動(dòng)物模型構(gòu)建評(píng)價(jià)及對(duì)脂肪移植物保留率的影響分別通過(guò)卵巢摘除(OVX組)、假手術(shù)(CON組)與皮下埋入17β-雌二醇藥片埋入(HE組),調(diào)控小鼠的雌激素水平45天,后行ELISA檢測(cè)小鼠血清雌激素水平;此時(shí)同時(shí)進(jìn)行同體積自體脂肪移植手術(shù),在移植后不同時(shí)間點(diǎn)取材稱重,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE)、免疫熒光觀察脂肪組織形態(tài)及組織學(xué)的結(jié)構(gòu)改變;RT-PCR進(jìn)行移植物中雌激素受體α(ERα)的表達(dá)量。2.雌激素在脂肪移植中對(duì)炎癥細(xì)胞的募集調(diào)控、脂肪再生及組織中血管形成的影響從移植區(qū)取下的脂肪移植物進(jìn)行膠原酶消化處理,提取SVF細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)中性粒細(xì)胞的含量、巨噬細(xì)胞進(jìn)行亞型分類(促炎巨噬細(xì)胞Ml型及抗炎巨噬細(xì)胞M2型)的表達(dá)百分比、RT-PCR檢測(cè)相應(yīng)巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子(TNF-α及IL-10)及脂肪組織中非血源性干細(xì)胞的含量進(jìn)行評(píng)估;基因芯片用于評(píng)估移植后一周的脂肪組織,并分析纖維化基因表達(dá);組織免疫熒光及RT-PCR對(duì)血管化、干細(xì)胞增殖、分化能力進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果1.不同雌激素濃度動(dòng)物模型構(gòu)建評(píng)價(jià)及對(duì)脂肪移植物保留率的影響(1)雌激素表達(dá)水平與移植前脂肪組織體積呈反比ELISA檢測(cè)小鼠血清雌激素濃度證實(shí)造模成功。HE組ERα表達(dá)量(3.07±1.1 pg/ml)為最高,而OXV組最低(3.07±l.lpg/ml)。造模45天后,低雌激素的小鼠脂肪墊重量要比其余兩組重2倍以上。(2)低水平雌激素可促進(jìn)早期脂肪再生、肥大及雌激素受體的高表達(dá)脂肪移植后在第十二周,OVX組保留率最高。HE、免疫熒光結(jié)果顯示:低雌激素組比正常雌激素及高雌激素組,在移植后第一周,可見(jiàn)大量脂肪組織被破壞并出現(xiàn)明顯脂滴聚集,到第二周時(shí)就開(kāi)始有豐富的多房脂肪細(xì)胞浸潤(rùn)。十二周時(shí),OVX組的脂肪細(xì)胞直徑明顯大于CON及HE組。ERα檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OVX組早期表達(dá)是下降的,但第四周時(shí)表達(dá)升高到第十二周時(shí)為表達(dá)的高峰。2.雌激素在脂肪移植中對(duì)炎癥細(xì)胞的調(diào)控、脂肪再生及血管化的影響(1)高雌激素生理環(huán)境可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不足及M1往M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換的異常在脂肪移植后急性炎癥反應(yīng)中,OVX組CDllb+粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞表面抗原)的浸潤(rùn)最為強(qiáng)烈。這個(gè)現(xiàn)象與我們發(fā)現(xiàn)OVX組中早期細(xì)胞被炎癥破壞,油滴釋出,進(jìn)而油囊產(chǎn)生的組織學(xué)表現(xiàn)相符合。第二周可見(jiàn)到OVX及CON兩組巨噬細(xì)胞表型開(kāi)始從M1往M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換,然而HE組早期Ml型局勢(shì)細(xì)胞浸潤(rùn)缺乏,而第二周開(kāi)始出現(xiàn)延遲的Ml浸潤(rùn)。結(jié)果提示HE組在早期促炎巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)不足,從而導(dǎo)致早期壞死脂肪的破壞減弱及后期清除壞死組織的不足。(2)低雌激素在脂肪移植物纖維化的評(píng)估雖然在馬松染色中未見(jiàn)因強(qiáng)烈炎癥導(dǎo)致包膜的增厚,但在基因芯片的微點(diǎn)陣圖中顯示:脂肪移植早期在OVX組就可有脂肪組織纖維化基因表達(dá)的傾向。因此,可解釋在OVX組中脂肪纖維化的標(biāo)志物膠原蛋白VI(COL-6)表達(dá)的增加。(3)在雌激素調(diào)控模型中早期血管生成水平與脂肪移植后的保留率不同步我們發(fā)現(xiàn)只有在正常雌激素濃度時(shí)移植物的血管化是最好。HE組在早期最高的血管化水平,但伴隨著脂肪組織的延遲壞死VEGF的表達(dá)量也隨之下降。然而,OVX組的早期血管化雖稍弱,但由于其充分的壞死吞噬與促炎信號(hào)提供與轉(zhuǎn)歸,為脂肪再生與肥大提供了適宜的微環(huán)境,最終獲得最高的保留率。(4)高雌激素對(duì)組織局部干細(xì)胞具有保護(hù)作用,但卻抑制了其脂肪細(xì)胞增殖、分化能力在實(shí)驗(yàn)中觀察到HE組擁有大量的局部干細(xì)胞的表達(dá),Ki67+表達(dá)量從第四周到第十二周呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì),但是PPAR-γ在第十二周時(shí)表達(dá)最低,因此我們認(rèn)為HE組的脂肪分化與脂質(zhì)沉積受到抑制。結(jié)論1.通過(guò)卵巢摘除、植入雌激素藥片處理后,成功構(gòu)建模擬雌激素生理濃度的動(dòng)物模型。2.卵巢摘除組中因低雌激素環(huán)境導(dǎo)致移植初期血管化無(wú)優(yōu)勢(shì),但除了誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞肥大之外,在卵巢摘除組移植早期大量募集中性粒細(xì)胞及M1巨噬細(xì)胞,及時(shí)浸潤(rùn)清除壞死脂肪組織,為后期脂肪再生提供空間條件。3.在孕期高雌激素環(huán)境中,脂肪有較高含量的干細(xì)胞,并易于早期建立/保留血管化成分。但由于雌激素對(duì)干擾急性炎癥反應(yīng)及成脂的抑制作用,移植物的保留率低且出現(xiàn)中心壞死,提示高劑量的激素替代治療可能干擾脂肪移植的術(shù)后的保留率。此實(shí)驗(yàn)為構(gòu)建的理想化模型,忽略小鼠年齡、性別差異及其他可能的荷爾蒙水平因素的干擾,然而通過(guò)分析在不同雌激素環(huán)境中脂肪移植物的存活機(jī)制,我們?yōu)榕R床研究提供更多的線索與更深入的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R622
【圖文】：

同組的單側(cè)腹股溝脂肪墊的重量測(cè)量顯示ＯＶＸ脂肪重量較重（０．１９±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑并且明顯重于ＨＥ組（０．０７±０．０２ｇ，ｎ＝４）邋（Ｐ＜０．０５）及ＣＯＮ組（０．１１±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑（Ｐ邋＜０．０５），而ＨＥ組則為三組中重量最輕的脂肪組織（見(jiàn)圖１－１Ｂ）。在進(jìn)行卵巢逡逑摘除及植入雌激素藥片４５天后，利用ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)各組移植前腹股溝脂肪墊中雌逡逑激素受體ａ邋（ＥＲａ）量，ＯＶＸ組的表達(dá)量（０．４５士０．２）低于ＨＥ組（３．０７±ｌ．ｌ）（ｐ＜０．０５），逡逑結(jié)果顯示ＥＲａ的表達(dá)量與體循環(huán)雌激素的濃度成正比。逡逑Ａ邐Ｄ邐ＩＮＧＵＩＮＡＬ邋ＦＡＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑Ａ．邐Ｂ．逡逑＊逡逑０．２５－１邐＿邐＊邐＊邐■逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ邐0２0＿邋丁逡逑１０＇１５＊邋ｖ逡逑０．０５－逡逑Ｉｎｇｕｉｎａｌ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ（ｌ邋ｍｏｎｔｈｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｐｙａｒｊｅｃｔｐｍｙ，逡逑ｅｓｔｒｏｇｅｎ邋ｉｍｐｌａｎｔ邋ｏｒ邋ｓｈａｍ邋）邐0邋Ｉ邐

同組的單側(cè)腹股溝脂肪墊的重量測(cè)量顯示ＯＶＸ脂肪重量較重（０．１９±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑并且明顯重于ＨＥ組（０．０７±０．０２ｇ，ｎ＝４）邋（Ｐ＜０．０５）及ＣＯＮ組（０．１１±０．０２ｇ，ｎ＝４）逡逑（Ｐ邋＜０．０５），而ＨＥ組則為三組中重量最輕的脂肪組織（見(jiàn)圖１－１Ｂ）。在進(jìn)行卵巢逡逑摘除及植入雌激素藥片４５天后，利用ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)各組移植前腹股溝脂肪墊中雌逡逑激素受體ａ邋（ＥＲａ）量，ＯＶＸ組的表達(dá)量（０．４５士０．２）低于ＨＥ組（３．０７±ｌ．ｌ）（ｐ＜０．０５），逡逑結(jié)果顯示ＥＲａ的表達(dá)量與體循環(huán)雌激素的濃度成正比。逡逑Ａ邐Ｄ邐ＩＮＧＵＩＮＡＬ邋ＦＡＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑Ａ．邐Ｂ．逡逑＊逡逑０．２５－１邐＿邐＊邐＊邐■逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ邐0２0＿邋丁逡逑１０＇１５＊邋ｖ逡逑０．０５－逡逑Ｉｎｇｕｉｎａｌ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ（ｌ邋ｍｏｎｔｈｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｐｙａｒｊｅｃｔｐｍｙ，逡逑ｅｓｔｒｏｇｅｎ邋ｉｍｐｌａｎｔ邋ｏｒ邋ｓｈａｍ邋）邐0邋Ｉ邐

Ａ），并且重量的保留率最好為５２％（０．００３±０．００１５％），而ＣＯＮ組移植物為逡逑肉粉色并且質(zhì)地細(xì)軟，其保留率則為２８％（０．００１６±０．０００５％），保留率最低的ＨＥ逡逑組為２２％邋（０．０００９５±０．０００５％）（戶＜０．０５）（見(jiàn)圖１－３，邋Ｂ）。這些移植物的重量不受逡逑到小鼠本身體重的影響。因此，我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為雌激素在自體脂肪移植中扮演逡逑者重要的角色。逡逑Ａ．邐Ｂ．逡逑ＯＶＸ邋ＣＯＮ邋ＨＥ逡逑１Ｗ邐一邐ＦＡＴ邋ＧＲＡＦＴ邋ＷＥＩＧＨＴ逡逑＾邋Ｏ．ＯＯ８－１邐＊逡逑ｒ，團(tuán)網(wǎng)邐ｉ邐－ｃ0Ｎ逡逑２ｗＵＩＩ！ＩＲｙｉ邐ｆ＿．ｈｅ逡逑ＤＱＥ９邐Ｉ。－逡逑ＣＯ邋0邋００２－逡逑６邋０．０００－１邋￣Ｉ邐１邐１邐１邐１—逡逑Ｕ邐１Ｗ邋２Ｗ邋４Ｗ邋８Ｗ邋１２Ｗ逡逑圖１－３腹股溝脂肪墊移植于小鼠頭皮下�？梢�(jiàn)ＯＶＸ組在第１２周時(shí)體積最大，呈黃白逡逑色并且觸感堅(jiān)韌富有彈性，ＣＯＮ組則呈現(xiàn)條狀質(zhì)地柔軟的脂肪組織，ＨＥ組移植物重量逡逑最輕并且呈小而軟的脂肪組織（Ａ）。各組在不同時(shí)間點(diǎn)脂肪移植相對(duì)于體重的相對(duì)重逡逑量保留率（＊為邋ＯＶＸｖｓ．邋ＨＥ邋組；？＜０．０５）（＃為邋ＣＯＮｖｓ．ＨＥ邋組尸＜０．０５）邋（Ｂ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｆａｔ邋ｐａｄｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｓｃａｌｐ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ．邋Ａｔ邋ｗｅｅｋ邋１２，邋ｇｒａｆｔｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ＯＶＸ邋ｇｒｏｕｐ邋ｌｏｏｋｅｄ邋ｙｅｌｌｏｗ邋ａｎｄ邋ｆｅｌｔ邋ｆｉｒｍ邋ａｎｄ邋ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ．邋Ｈｏｗｅｖｅｒ

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