【摘要】：研究背景燒傷后創(chuàng)面愈合問(wèn)題顯著降低了患者的心理和身體的生存質(zhì)量,甚至?xí){他們的生命。近年來(lái)許多治療方法應(yīng)用到臨床創(chuàng)面治療上,包括干細(xì)胞治療,但是目前依然沒(méi)有完美有效的治療方法。因此,我們急需一種完美修復(fù)創(chuàng)面而且價(jià)格又可以承受的治療方法應(yīng)用于燒傷的創(chuàng)面治療。表皮干細(xì)胞主要來(lái)源于皮膚基底層,占基底層細(xì)胞數(shù)的2%4%,具有分化為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚其他附屬器官的潛能,并且是皮膚組織創(chuàng)傷再生和修復(fù)的理想的種子細(xì)胞。表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)記物有Cytokeratin(CK)19和lntegrin-β 1(β 1),分化為成熟的角質(zhì)形成細(xì)胞后則CK10表達(dá)陽(yáng)性。CD271,是神經(jīng)生長(zhǎng)因子的受體,即p75受體,可以調(diào)節(jié)多種干細(xì)胞的增殖、凋亡和分化,并且還有研究表明CD271可能在促進(jìn)皮膚的創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著重要作用,然而表皮干細(xì)胞中的CD271促進(jìn)創(chuàng)面愈合的具體機(jī)制卻不明了。作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子的另一個(gè)受體TrkA,既往研究提示CD271和TrkA可以互相調(diào)控彼此的表達(dá),CD271和TrkA的比率關(guān)系也可以影響細(xì)胞的增殖能力等。然而在皮膚中,尤其是表皮干細(xì)胞中CD271是否受到TrkA的調(diào)控作用并不明確。另外ERK、AKT和JNK信號(hào)通路也可能參與皮膚的創(chuàng)面愈合過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)意在研究在皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中,CD271的過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞是否可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合,以及CD271是否聯(lián)合TrkA在創(chuàng)面愈合過(guò)程中通過(guò)促進(jìn)表皮干細(xì)胞的遷移和增殖進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。目的探討CD271是否影響表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性及是否促進(jìn)創(chuàng)面愈合,并且進(jìn)一步研究表皮干細(xì)胞中的TrkA在CD271引起的創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用和機(jī)制。材料和方法1、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)所涉及到的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的處理依從山東大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的行為規(guī)范。提取新出生的乳鼠皮膚,使用25%的戊巴比妥溶液麻醉乳鼠,處死乳鼠,75%的酒精消毒皮膚,鋪巾,取下乳鼠背部腹部的全部皮膚,放入2~3ml冰的PBS溶液中。在超凈臺(tái)操作,采用DispaseII酶消化的方法取下表皮層,丟棄真皮層,將剝離的表皮層用PBS沖洗三次,使用無(wú)菌剪刀剪碎,放入0.05%的胰酶室溫下消化10分鐘,用表皮細(xì)胞的全培養(yǎng)基終止消化,用200目的濾網(wǎng)過(guò)濾后,l000rmp,5分鐘,室溫離心,棄去上清,加入適量的表皮干細(xì)胞專用KSFM培養(yǎng)基(Serum-free medium,Gibco)混勻,放入37℃、5%CO2的細(xì)胞孵育箱里面培養(yǎng)。3天后更換培養(yǎng)基,提前預(yù)熱37℃的PBS輕輕沖洗不能貼壁的細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到80%~90%以上的時(shí)候給予傳代。(2)轉(zhuǎn)染慢病毒把表皮干細(xì)胞(P3)鋪在96孔板里,培養(yǎng)24小時(shí),然后提前一天轉(zhuǎn)染慢病毒,以1×105/孔的細(xì)胞鋪到24孔板中。培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量為2×105/孔左右,轉(zhuǎn)染慢病毒。用含6 u g/ml polybrene的2~3ml新鮮的培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基后,然后再加入適量的病毒懸液。37°C孵育。4小時(shí)后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,再用新鮮培養(yǎng)基替換原來(lái)含有病毒的舊的培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。用敲除了 CD271的慢病毒(含有熒光蛋白),在轉(zhuǎn)染病毒48小時(shí)后,轉(zhuǎn)染效率高,可見有很多熒光表達(dá),72小時(shí)后會(huì)更加明顯。(3)應(yīng)用K252a降低TrkA的表達(dá)將CD271正常表達(dá)和CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)在表皮干細(xì)胞專用培養(yǎng)基中并鋪板使密度大概為1× 105左右,并使用100nM K252a(Santa Cruz Biotechnology Company,CA)預(yù)處理 24 小時(shí)。(4)細(xì)胞增殖能力檢測(cè)將CD271過(guò)表達(dá)、低表達(dá)及正常對(duì)照組表皮干細(xì)胞(P4),以及給予K252a試劑干預(yù)后的表皮干細(xì)胞使用細(xì)胞克隆、CCK-8和細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒等方法進(jìn)行檢測(cè)。(5)細(xì)胞遷移能力檢測(cè)為了檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,我們使用了 Transwell實(shí)驗(yàn)。小室膜孔徑8 μm,各組細(xì)胞種于小室上層,小室上層為無(wú)表皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基,下層為表皮干細(xì)胞專用培養(yǎng)基。用孵箱培養(yǎng)各組細(xì)胞24小時(shí),用PBS沖洗,再用棉簽擦去Transwell上室內(nèi)的細(xì)胞,用95%的乙醇固定微孔膜下層的細(xì)胞,再蘇木素染色2分鐘,通過(guò)采用表皮生長(zhǎng)因子作為誘導(dǎo),計(jì)數(shù)相同面積下穿透聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)量,以此判斷細(xì)胞的遷移能力。(6)細(xì)胞凋亡能力檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)可以用于檢測(cè)表皮干細(xì)胞的凋亡能力。Q2代表著凋亡的比率,Q4代表著死亡的比率。將表皮干細(xì)胞,大約IX 106個(gè)細(xì)胞每孔,消化下來(lái)再用5 μ 1的PE-7-AAD和Annexin-V-FITC染色,在室溫下避光染色15分鐘。Hoechst 3342/PI或者TUNEL/DAPI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。將處理過(guò)的的表皮干細(xì)胞,大約1×106個(gè)細(xì)胞每孔,提前24小時(shí)種到24孔板里。再用PBS清洗后,Hoechst33342/PI或者TUNEL/DAPI加入到培養(yǎng)基里并孵育15分鐘。在熒光顯微鏡底下觀察,并即時(shí)拍照計(jì)數(shù)死亡和所有的細(xì)胞。2、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)深I(lǐng)I度燒傷模型設(shè)計(jì)隨機(jī)抽取C57BL/6小鼠(6周,雄性,2025克)。首先給予25%戊巴比妥溶液麻醉6周齡的雄性小鼠,35mg/kg,成功麻醉后,將小鼠背毛剃除干凈,碘伏酒精消毒,在100℃水浴直徑0.5厘米的銅塊放于小鼠背部4秒鐘,制作深I(lǐng)I度燒傷模型。動(dòng)態(tài)觀察小鼠燒傷創(chuàng)面愈合的過(guò)程,在0天、7天、14天和21天分別取材。(2)皮膚全層缺失的模型設(shè)計(jì)C57BL/6小鼠(6周,雄性,20～25克),給予正常飲食,將小鼠麻醉(給予25%戊巴比妥,35mg/kg),剃去小鼠的毛發(fā),并75%酒精消毒,使用直徑大小0.5厘米的模具在小鼠背部制作創(chuàng)面,然后使用5ml的林格液復(fù)蘇麻醉的小鼠。在0天、3天和7天拍照測(cè)量創(chuàng)面面積,并在7天時(shí)取小鼠創(chuàng)面包括周邊2mm的皮膚,用于做免疫組織化學(xué)染色和Western blot實(shí)驗(yàn)分析。(3)K252a藥物抑制TrkA表達(dá)的動(dòng)物模型制備K252a 是 TrkA 受體的抑制劑[36,37]。購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology 公司。15μgK252a(10μg/mg)溶解在含2%的DMS0的生理鹽水中,在-20°C的黑暗環(huán)境中保存。C57BL/6小鼠(20~25克,雄性,6周)隨機(jī)分成4組,每組5只。在Control組和CD271組腹腔注射含2%DMS0的生理鹽水,在K252a組和CD271+K252a組則注射溶解有K252a藥物的2%DMS0生理鹽水(5μg/kg)。提取皮膚組織蛋白,Western blot方法檢測(cè)TrkA的表達(dá)情況。(4)表皮千細(xì)胞干預(yù)創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)4.1 C57BL/6小鼠(6周,雄性,20~25克)隨機(jī)分組,每組6只小鼠,按照上述的步驟制作深I(lǐng)I度燒傷模型。將等體積(150 μl PBS)且等細(xì)胞數(shù)量(1X 10～7)的四代CD271正常表達(dá)和CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞注射到制作創(chuàng)面后的當(dāng)天、3天和5天的創(chuàng)面周圍5mm的真皮層。隨后在當(dāng)天、7天、14天和21天時(shí)測(cè)量創(chuàng)面面積并拍照。創(chuàng)面的面積采用游標(biāo)卡尺測(cè)量。在第21天的時(shí)候取創(chuàng)面及周邊的皮膚,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況。4.2使用K252a(5 μg/kg)腹部注射制作TrkA表達(dá)缺失的小鼠模型。Western blot檢測(cè)在皮膚組織中TrkA表達(dá)缺失后,按照上述描述(2)制作直徑0.5厘米的皮膚全層缺失的創(chuàng)面模型。同理將等體積且等細(xì)胞數(shù)量的正常及CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞注射到制作創(chuàng)面后的當(dāng)天、3天和5天的創(chuàng)面周圍皮膚的真皮層中,然后在當(dāng)天、3天和7天時(shí)測(cè)量創(chuàng)面面積并拍照。在第7天的時(shí)候取創(chuàng)面及周邊的皮膚,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況。(5)免疫組織化學(xué)染色1)脫蠟:60°C條件下烘片,將片子然后依次放入無(wú)水的乙醇,95%的乙醇,85%的乙醇,70%的乙醇和蒸餾水中,2)抗原修復(fù):把抗原修復(fù)液預(yù)熱,再把切片放入修復(fù)液中,繼續(xù)加熱約1分鐘后關(guān)掉電源,自然冷卻到室溫,3)免疫組織化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)過(guò)程:內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫下封閉20~30分鐘后;然后按照一抗說(shuō)明書稀釋一抗(β 1,CD271,CK19和CK10),滴加一抗后4°C過(guò)夜孵育;37°C下滴加Polymer helper后孵育20～30分鐘;在37°C下滴加生物素化二抗后孵育20～30分鐘;最后用DAB染色后在顯微鏡底下觀察;最后用蘇木素染色;等片子干燥后封片,加中性樹膠覆蓋片子,晾干;顯微鏡拍照。(6)Western blot 檢測(cè)按照實(shí)驗(yàn)步驟提取各組細(xì)胞和動(dòng)物皮膚組織中的蛋白,灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜孵育一抗過(guò)夜后,顯影檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中CD271和表皮干細(xì)胞表面標(biāo)記物,如CK10、CK19和β 1的表達(dá)。同時(shí)測(cè)定磷酸化Akt,ERK和JNK信號(hào)通路的表達(dá)變化情況。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間正態(tài)分布的數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析,t檢驗(yàn)。多組之間數(shù)據(jù)的比較使用AN0VA檢驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研究中所得的數(shù)據(jù)均使用(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)表示。當(dāng)P0.05的時(shí)候,說(shuō)明數(shù)據(jù)具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(1)CD271調(diào)控表皮干細(xì)胞的分化表皮干細(xì)胞的分化能力在皮膚創(chuàng)面愈合過(guò)程中發(fā)揮作用。因此我們實(shí)驗(yàn)研究了 CD271在表皮干細(xì)胞中的分化作用。將表皮干細(xì)胞培養(yǎng)在膠原包被的培養(yǎng)瓶中,通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒我們得到CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞(CD271-vo eSCs)和CD271低表達(dá)的表皮干細(xì)胞(CD271-kd eSCs)以及轉(zhuǎn)染了空病毒的對(duì)照組表皮干細(xì)胞(Control eSCs)�？梢酝ㄟ^(guò)判斷帶有綠色熒光的細(xì)胞來(lái)判斷病毒是否轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功,并可以粗略判斷轉(zhuǎn)染效率。免疫組織化學(xué)染色和Western blot結(jié)果顯示我們得到CD271-vo表皮干細(xì)胞和CD271-kd表皮干細(xì)胞以及對(duì)照組表皮干細(xì)胞。CD271在表皮干細(xì)胞的分化作用利用CK10、CK19和β 1的表達(dá)量多少來(lái)表示。當(dāng)CD271過(guò)表達(dá)時(shí),CK10表達(dá)升高而CK19表達(dá)下降,相反的,當(dāng)CD271低表達(dá)時(shí),CK10表達(dá)降低而CK19和βl表達(dá)升高。這些結(jié)果表明CD271可以有效的調(diào)控表皮干細(xì)胞的分化。(2)CD271調(diào)控表皮干細(xì)胞的增殖凋亡和遷移能力接下來(lái)我們檢測(cè)了 CD271對(duì)于表皮干細(xì)胞凋亡和增殖方面的影響。我們使用了流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞克隆和CCK-8等方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。對(duì)比Control組表皮干細(xì)胞,CD271-vo表皮干細(xì)胞G2期增多,CD271-kd表皮干細(xì)胞G2期減少。在細(xì)胞克隆和CCK-8測(cè)細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中我們也可以得到類似的結(jié)果。表皮干細(xì)胞的凋亡能力用Hochest/PI染色、TUNEL/DAPI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),得到跟增殖能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)觀點(diǎn)一致的結(jié)論。Transwell實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,CD271-vo表皮干細(xì)胞的遷移能力增高而CD271-kd表皮干細(xì)胞遷移能力下降。這些結(jié)果顯示CD271促進(jìn)了表皮干細(xì)胞的增殖能力和遷移能力。(3)CD271可以調(diào)節(jié)TrkA的表達(dá)TrkA是神經(jīng)生長(zhǎng)因子的另一個(gè)受體。有研究表明TrkA和CD271表達(dá)的比率可以通過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子影響細(xì)胞的增殖和存活。所以我們使用了免疫組織化學(xué)染色和Western blot對(duì)TrkA在細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。當(dāng)CD271表達(dá)增高時(shí)TrkA表達(dá)降低,當(dāng)CD271表達(dá)降低時(shí)TrkA表達(dá)增高。(4)K252a抑制表皮干細(xì)胞的TrkA表達(dá)后,CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞的凋亡能力增加前文已經(jīng)說(shuō)到,K252a是抑制TrkA受體的試劑。通過(guò)轉(zhuǎn)染慢病毒和加藥,我們得到對(duì)照組的表皮干細(xì)胞(Control eSCs),CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞(CD271 eSCs),與K252a共培養(yǎng)的正常表皮干細(xì)胞(K252a eSCs)和CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞(CD271 eSCs+K252a)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Control組,CD271 eSCs組,K252a eSCs組和CD271 eSCs+K252a組這四組細(xì)胞表達(dá)CD271的情況。我們采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)Q2+Q4的比率水平來(lái)比較各組之間凋亡能力。我們發(fā)現(xiàn)與不加K252a的Control組和CD271 eSCs組相比,加K252a后的兩組的Q2+Q4比率均增高,并且CD271過(guò)表達(dá)同時(shí)TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a組在各組中凋亡水平的增高是最明顯的。與TUNEL染色結(jié)果一致。TrkA抑制后即使CD271過(guò)表達(dá),也會(huì)增加表皮干細(xì)胞的凋亡能力。(5)K252a抑制表皮干細(xì)胞的TrkA表達(dá)后,CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞的增殖能力降低K252a是常用的抑制TrkA表達(dá)的抑制劑。通過(guò)Western blot判斷TrkA被抑制的效率,我們的實(shí)驗(yàn)中TrkA完全抑制表達(dá),然后再做流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期。我們發(fā)現(xiàn)與不加K252a組相比,加K252a后的兩組的G2期均下降,并且CD271過(guò)表達(dá)同時(shí)TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a組在各組中是增殖能力降低最明顯的。與細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。TrkA抑制后即使CD271過(guò)表達(dá)也可以降低表皮干細(xì)胞的增殖能力。(6)K252a抑制表皮干細(xì)胞的TrkA表達(dá)后,CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞的遷移能力下降K252a是抑制TrkA受體的試劑。我們Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)細(xì)胞穿膜的細(xì)胞數(shù)目水平來(lái)比較各組之間遷移能力。我們發(fā)現(xiàn)與不加K252a的Control組和CD271 eSCs組相比,加K252a后的K252a組和CD271+K252a組的穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目顯著減少,并且CD271過(guò)表達(dá)同時(shí)TrkA抑制的表皮干細(xì)胞組在各組中是穿出細(xì)胞數(shù)目是最少的。TrkA抑制后可以降低表皮干細(xì)胞的遷移能力,并且CD271過(guò)表達(dá)但TrkA不表達(dá)也會(huì)引起表皮干細(xì)胞的遷移能力下降。(7)抑制TrkA表達(dá)后,ERK和Akt信號(hào)通路的表達(dá)降低為了探索可能參與的信號(hào)通路,我們提取了 Control組的表皮干細(xì)胞,CD271 eSCs組的表皮干細(xì)胞,與K252a共培養(yǎng)的K252a eSCs組表皮干細(xì)胞和CD271eSCs+K252a組的表皮干細(xì)胞這四組細(xì)胞的蛋白。利用Western blot的方法測(cè)定了 pERK,pAkt和pJNK的蛋白表達(dá)水平變化。與Control組的表皮干細(xì)胞相比,pERK和pAkt在CD271 eSCs中表達(dá)增多,而且在CD271 eSCs+K252a中表達(dá)最少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞與K252a共培養(yǎng)時(shí),pJNK表達(dá)增高,并且與CD271的表達(dá)高低無(wú)關(guān)。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(1)CD271在燒傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中表達(dá)增多檢測(cè)CD271在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的變化情況,CD271表達(dá)在創(chuàng)面愈合的中、后期表達(dá)越來(lái)越高。把在100°C沸水中浸的銅塊放在已經(jīng)剃除毛發(fā)的小鼠背部4秒鐘,得到深I(lǐng)I度燒傷的創(chuàng)面模型。深I(lǐng)I度燒傷會(huì)累及殘留了表皮干細(xì)胞的皮膚的表皮層及真皮層。通過(guò)檢測(cè)表皮干細(xì)胞的表面標(biāo)記物(CK19、β1),我們發(fā)現(xiàn)表皮干細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過(guò)程中不斷增加,參與創(chuàng)面愈合的過(guò)程。我們可以看到創(chuàng)面在第7天和14天時(shí)開始愈合,并在第21天時(shí)完全愈合。我們?cè)趧?chuàng)面愈合過(guò)程不同的階段取材,動(dòng)態(tài)觀察創(chuàng)面愈合的過(guò)程。我們發(fā)現(xiàn)CD271在第7天的時(shí)候下降了,但是在第14天和21天時(shí)表達(dá)增高了。然而CK10在第7天的時(shí)候表達(dá)降低,而在第14天和21天時(shí)表達(dá)增高。而免疫組織化學(xué)染色顯示,CD271和CK19在創(chuàng)面愈合過(guò)程中主要表達(dá)在增厚的表皮層。β1在基底層也表達(dá)增高了。CK19的表達(dá)在第7天的時(shí)候減少了,在第21天的時(shí)候增加。這些結(jié)果表明伴隨著表皮干細(xì)胞的增加,CD271參與創(chuàng)面中、晚期愈合過(guò)程。(2)CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合通過(guò)CD271正常表達(dá)和CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞干預(yù)創(chuàng)面愈合以此判斷CD271對(duì)創(chuàng)面愈合情況的影響。與注射CD271正常表達(dá)的表皮干細(xì)胞相比,注射CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞的創(chuàng)面在愈合時(shí)間和愈合質(zhì)量上都有提升。這些結(jié)果表明CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞更加可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。(3)TrkA可以輔助CD271促進(jìn)創(chuàng)面的愈合通過(guò)腹腔注射K252a(5ug/kg)得到TrkA表達(dá)缺失的小鼠,取小鼠皮膚提取蛋白,通過(guò)Western blot方法驗(yàn)證得到皮膚中TrkA表達(dá)缺失的小鼠模型。制備好全層皮膚缺失的小鼠。愈合模型實(shí)驗(yàn):將小鼠分為給予正常表達(dá)表皮干細(xì)胞的正常對(duì)照組(Control組),給予CD271過(guò)表達(dá)表皮干細(xì)胞的CD271組,預(yù)處理過(guò)K252a的給予CD271正常表達(dá)的表皮干細(xì)胞的K252a組和預(yù)處理過(guò)K252a的給予CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞的CD271+K252a組。在術(shù)后的當(dāng)天、3天和5天的時(shí)候,Control組和K252a組給予CD271正常表達(dá)表皮干細(xì)胞,CD271組和CD271+K252a組給予CD271過(guò)表達(dá)表皮干細(xì)胞的處理。在創(chuàng)面的周邊皮膚5mm,注射到皮膚的真皮層。從第3天開始,我們可以看到CD271過(guò)表達(dá)組創(chuàng)面愈合最快,CD271+K252a愈合最慢,但是在TrkA阻滯后的情況下,CD271過(guò)表達(dá)并不能引起創(chuàng)面的愈合加快。取上述各組創(chuàng)面愈合第7天時(shí)的皮膚組織,進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)得出,CD271+K252a組的創(chuàng)面愈合邊緣,集聚著數(shù)量最少的處在增殖期的細(xì)胞,和最少量的表皮干細(xì)胞。結(jié)論我們的實(shí)驗(yàn)揭示了CD271促進(jìn)表皮干細(xì)胞的分化、增殖和遷移,CD271在深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合過(guò)程的中、后期,也就是再上皮化和重構(gòu)過(guò)程中的起著重要作用。目前的發(fā)現(xiàn)可以將CD271和表皮干細(xì)胞視作很有前途的治療創(chuàng)面愈合的靶點(diǎn)。CD271在創(chuàng)面的早期降低,而在中、后期增高,表明CD271在創(chuàng)面愈合的中、后期階段起作用。我們?cè)趧?chuàng)面愈合的早期通過(guò)表皮干細(xì)胞干預(yù)創(chuàng)面的愈合進(jìn)程,得出表皮干細(xì)胞可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合,而CD271可以加速表皮干細(xì)胞的增殖分化和遷移,以此促進(jìn)皮膚的創(chuàng)面愈合過(guò)程的結(jié)論。除此之外,神經(jīng)生長(zhǎng)因子的另一個(gè)受體TrkA的表達(dá)在CD271過(guò)表達(dá)的表皮干細(xì)胞中表達(dá)降低了。之前的研究顯示TrkA的作用不明確,可能促進(jìn),也可能抑制細(xì)胞的生物學(xué)特性,也有實(shí)驗(yàn)表明TrkA和CD271的比率會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。因此為了進(jìn)一步明確TrkA在CD271促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,我們抑制TrkA的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)即使CD271的增高并不會(huì)引起表皮干細(xì)胞的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用。即在CD271的過(guò)表達(dá)的情況下,TrkA受體的存在可能啟動(dòng)了比率機(jī)制引起表皮干細(xì)胞的增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)還展示了在促進(jìn)創(chuàng)面愈合過(guò)程中,CD271和TrkA可能會(huì)通過(guò)ERK和Akt信號(hào)通路起作用。綜上所述,這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)闡述了 CD271可以通過(guò)促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖分化遷移促進(jìn)創(chuàng)面愈合;CD271聯(lián)合TrkA在創(chuàng)面愈合過(guò)程中起著重要作用,而且表明了一個(gè)潛在的機(jī)制——在TrkA存在的條件下,CD271通過(guò)促進(jìn)表皮干細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)而可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的愈合。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R64
【圖文】：

圖１燒傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中ＣＤ２Ｈ和表皮干細(xì)胞表達(dá)增Ａ在小鼠（５只）背部制作燒傷創(chuàng)面（直徑０．５厘米）后，在創(chuàng)面后２１天取材。將創(chuàng)面皮膚磨碎并提取蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測(cè)ＣＤ２７１、Ｃ和Ｐ邋１變化情況。Ｂ用ＩｍａｇｅＪ軟件分析Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ條帶灰度值，－ａｃｔｉｎ相比的相對(duì)蛋白表達(dá)比值作圖，ＡＮ０ＶＡ檢測(cè)，＊尸＜０．邋０５。逡逑５０逡逑

圖２燒傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中ＣＤ２７１和表皮干細(xì)胞主要表達(dá)在Ａ－Ｂ在小鼠燒傷創(chuàng)面后第７天取材，做免疫組織化學(xué)染色。切片后進(jìn)行ＣＤ２７１、ＣＫ１０、ＣＫ１９和Ｐ邋１的免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)尺為１２０邋ｙ的創(chuàng)面愈合皮膚的表皮層的免疫組織化學(xué)染色的圖片插在原圖片中

圖３培養(yǎng)和鑒定原代表皮干細(xì)胞逡逑Ａ將培養(yǎng)了邋３天、１０天的表皮干細(xì)胞拍照，標(biāo)尺為１２０邋ｕｎｉ

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 王一兵;;創(chuàng)面修復(fù)長(zhǎng)路漫漫[J];中華燒傷雜志;2014年02期

2 黃曉元;;更進(jìn)一步提高深度燒傷創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量[J];中華燒傷雜志;2009年01期

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本文編號(hào)：2769537