【摘要】：研究背景燒傷后創(chuàng)面愈合問題顯著降低了患者的心理和身體的生存質(zhì)量,甚至會威脅他們的生命。近年來許多治療方法應用到臨床創(chuàng)面治療上,包括干細胞治療,但是目前依然沒有完美有效的治療方法。因此,我們急需一種完美修復創(chuàng)面而且價格又可以承受的治療方法應用于燒傷的創(chuàng)面治療。表皮干細胞主要來源于皮膚基底層,占基底層細胞數(shù)的2%4%,具有分化為表皮角質(zhì)形成細胞和皮膚其他附屬器官的潛能,并且是皮膚組織創(chuàng)傷再生和修復的理想的種子細胞。表皮干細胞的表面標記物有Cytokeratin(CK)19和lntegrin-β 1(β 1),分化為成熟的角質(zhì)形成細胞后則CK10表達陽性。CD271,是神經(jīng)生長因子的受體,即p75受體,可以調(diào)節(jié)多種干細胞的增殖、凋亡和分化,并且還有研究表明CD271可能在促進皮膚的創(chuàng)面愈合過程中起著重要作用,然而表皮干細胞中的CD271促進創(chuàng)面愈合的具體機制卻不明了。作為神經(jīng)生長因子的另一個受體TrkA,既往研究提示CD271和TrkA可以互相調(diào)控彼此的表達,CD271和TrkA的比率關(guān)系也可以影響細胞的增殖能力等。然而在皮膚中,尤其是表皮干細胞中CD271是否受到TrkA的調(diào)控作用并不明確。另外ERK、AKT和JNK信號通路也可能參與皮膚的創(chuàng)面愈合過程。本實驗意在研究在皮膚創(chuàng)面愈合過程中,CD271的過表達的表皮干細胞是否可以促進創(chuàng)面愈合,以及CD271是否聯(lián)合TrkA在創(chuàng)面愈合過程中通過促進表皮干細胞的遷移和增殖進而促進創(chuàng)面愈合。目的探討CD271是否影響表皮干細胞的生物學特性及是否促進創(chuàng)面愈合,并且進一步研究表皮干細胞中的TrkA在CD271引起的創(chuàng)面愈合過程中的作用和機制。材料和方法1、體外細胞實驗(1)表皮干細胞的分離培養(yǎng)本實驗所涉及到的動物實驗的處理依從山東大學動物倫理委員會的行為規(guī)范。提取新出生的乳鼠皮膚,使用25%的戊巴比妥溶液麻醉乳鼠,處死乳鼠,75%的酒精消毒皮膚,鋪巾,取下乳鼠背部腹部的全部皮膚,放入2~3ml冰的PBS溶液中。在超凈臺操作,采用DispaseII酶消化的方法取下表皮層,丟棄真皮層,將剝離的表皮層用PBS沖洗三次,使用無菌剪刀剪碎,放入0.05%的胰酶室溫下消化10分鐘,用表皮細胞的全培養(yǎng)基終止消化,用200目的濾網(wǎng)過濾后,l000rmp,5分鐘,室溫離心,棄去上清,加入適量的表皮干細胞專用KSFM培養(yǎng)基(Serum-free medium,Gibco)混勻,放入37℃、5%CO2的細胞孵育箱里面培養(yǎng)。3天后更換培養(yǎng)基,提前預熱37℃的PBS輕輕沖洗不能貼壁的細胞,當細胞長到80%~90%以上的時候給予傳代。(2)轉(zhuǎn)染慢病毒把表皮干細胞(P3)鋪在96孔板里,培養(yǎng)24小時,然后提前一天轉(zhuǎn)染慢病毒,以1×105/孔的細胞鋪到24孔板中。培養(yǎng)細胞數(shù)量為2×105/孔左右,轉(zhuǎn)染慢病毒。用含6 u g/ml polybrene的2~3ml新鮮的培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基后,然后再加入適量的病毒懸液。37°C孵育。4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。繼續(xù)培養(yǎng)細胞,再用新鮮培養(yǎng)基替換原來含有病毒的舊的培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)細胞。用敲除了 CD271的慢病毒(含有熒光蛋白),在轉(zhuǎn)染病毒48小時后,轉(zhuǎn)染效率高,可見有很多熒光表達,72小時后會更加明顯。(3)應用K252a降低TrkA的表達將CD271正常表達和CD271過表達的表皮干細胞培養(yǎng)在表皮干細胞專用培養(yǎng)基中并鋪板使密度大概為1× 105左右,并使用100nM K252a(Santa Cruz Biotechnology Company,CA)預處理 24 小時。(4)細胞增殖能力檢測將CD271過表達、低表達及正常對照組表皮干細胞(P4),以及給予K252a試劑干預后的表皮干細胞使用細胞克隆、CCK-8和細胞增殖檢測試劑盒等方法進行檢測。(5)細胞遷移能力檢測為了檢測細胞的遷移能力,我們使用了 Transwell實驗。小室膜孔徑8 μm,各組細胞種于小室上層,小室上層為無表皮生長因子的培養(yǎng)基,下層為表皮干細胞專用培養(yǎng)基。用孵箱培養(yǎng)各組細胞24小時,用PBS沖洗,再用棉簽擦去Transwell上室內(nèi)的細胞,用95%的乙醇固定微孔膜下層的細胞,再蘇木素染色2分鐘,通過采用表皮生長因子作為誘導,計數(shù)相同面積下穿透聚碳酸酯膜的細胞數(shù)量,以此判斷細胞的遷移能力。(6)細胞凋亡能力檢測流式細胞術(shù)可以用于檢測表皮干細胞的凋亡能力。Q2代表著凋亡的比率,Q4代表著死亡的比率。將表皮干細胞,大約IX 106個細胞每孔,消化下來再用5 μ 1的PE-7-AAD和Annexin-V-FITC染色,在室溫下避光染色15分鐘。Hoechst 3342/PI或者TUNEL/DAPI雙染實驗檢測細胞的凋亡。將處理過的的表皮干細胞,大約1×106個細胞每孔,提前24小時種到24孔板里。再用PBS清洗后,Hoechst33342/PI或者TUNEL/DAPI加入到培養(yǎng)基里并孵育15分鐘。在熒光顯微鏡底下觀察,并即時拍照計數(shù)死亡和所有的細胞。2、體內(nèi)動物實驗(1)深I(lǐng)I度燒傷模型設(shè)計隨機抽取C57BL/6小鼠(6周,雄性,2025克)。首先給予25%戊巴比妥溶液麻醉6周齡的雄性小鼠,35mg/kg,成功麻醉后,將小鼠背毛剃除干凈,碘伏酒精消毒,在100℃水浴直徑0.5厘米的銅塊放于小鼠背部4秒鐘,制作深I(lǐng)I度燒傷模型。動態(tài)觀察小鼠燒傷創(chuàng)面愈合的過程,在0天、7天、14天和21天分別取材。(2)皮膚全層缺失的模型設(shè)計C57BL/6小鼠(6周,雄性,20～25克),給予正常飲食,將小鼠麻醉(給予25%戊巴比妥,35mg/kg),剃去小鼠的毛發(fā),并75%酒精消毒,使用直徑大小0.5厘米的模具在小鼠背部制作創(chuàng)面,然后使用5ml的林格液復蘇麻醉的小鼠。在0天、3天和7天拍照測量創(chuàng)面面積,并在7天時取小鼠創(chuàng)面包括周邊2mm的皮膚,用于做免疫組織化學染色和Western blot實驗分析。(3)K252a藥物抑制TrkA表達的動物模型制備K252a 是 TrkA 受體的抑制劑[36,37]。購自 Santa Cruz Biotechnology 公司。15μgK252a(10μg/mg)溶解在含2%的DMS0的生理鹽水中,在-20°C的黑暗環(huán)境中保存。C57BL/6小鼠(20~25克,雄性,6周)隨機分成4組,每組5只。在Control組和CD271組腹腔注射含2%DMS0的生理鹽水,在K252a組和CD271+K252a組則注射溶解有K252a藥物的2%DMS0生理鹽水(5μg/kg)。提取皮膚組織蛋白,Western blot方法檢測TrkA的表達情況。(4)表皮千細胞干預創(chuàng)面愈合的實驗4.1 C57BL/6小鼠(6周,雄性,20~25克)隨機分組,每組6只小鼠,按照上述的步驟制作深I(lǐng)I度燒傷模型。將等體積(150 μl PBS)且等細胞數(shù)量(1X 10～7)的四代CD271正常表達和CD271過表達的表皮干細胞注射到制作創(chuàng)面后的當天、3天和5天的創(chuàng)面周圍5mm的真皮層。隨后在當天、7天、14天和21天時測量創(chuàng)面面積并拍照。創(chuàng)面的面積采用游標卡尺測量。在第21天的時候取創(chuàng)面及周邊的皮膚,檢測相關(guān)指標的表達情況。4.2使用K252a(5 μg/kg)腹部注射制作TrkA表達缺失的小鼠模型。Western blot檢測在皮膚組織中TrkA表達缺失后,按照上述描述(2)制作直徑0.5厘米的皮膚全層缺失的創(chuàng)面模型。同理將等體積且等細胞數(shù)量的正常及CD271過表達的表皮干細胞注射到制作創(chuàng)面后的當天、3天和5天的創(chuàng)面周圍皮膚的真皮層中,然后在當天、3天和7天時測量創(chuàng)面面積并拍照。在第7天的時候取創(chuàng)面及周邊的皮膚,檢測相關(guān)指標的表達情況。(5)免疫組織化學染色1)脫蠟:60°C條件下烘片,將片子然后依次放入無水的乙醇,95%的乙醇,85%的乙醇,70%的乙醇和蒸餾水中,2)抗原修復:把抗原修復液預熱,再把切片放入修復液中,繼續(xù)加熱約1分鐘后關(guān)掉電源,自然冷卻到室溫,3)免疫組織化學染色的實驗過程:內(nèi)源性過氧化物酶室溫下封閉20~30分鐘后;然后按照一抗說明書稀釋一抗(β 1,CD271,CK19和CK10),滴加一抗后4°C過夜孵育;37°C下滴加Polymer helper后孵育20～30分鐘;在37°C下滴加生物素化二抗后孵育20～30分鐘;最后用DAB染色后在顯微鏡底下觀察;最后用蘇木素染色;等片子干燥后封片,加中性樹膠覆蓋片子,晾干;顯微鏡拍照。(6)Western blot 檢測按照實驗步驟提取各組細胞和動物皮膚組織中的蛋白,灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜孵育一抗過夜后,顯影檢測實驗中CD271和表皮干細胞表面標記物,如CK10、CK19和β 1的表達。同時測定磷酸化Akt,ERK和JNK信號通路的表達變化情況。3、統(tǒng)計學分析對上述實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組之間正態(tài)分布的數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析,t檢驗。多組之間數(shù)據(jù)的比較使用AN0VA檢驗。本實驗研究中所得的數(shù)據(jù)均使用(平均值土標準差)表示。當P0.05的時候,說明數(shù)據(jù)具有明顯的統(tǒng)計學意義。實驗結(jié)果1、細胞實驗(1)CD271調(diào)控表皮干細胞的分化表皮干細胞的分化能力在皮膚創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮作用。因此我們實驗研究了 CD271在表皮干細胞中的分化作用。將表皮干細胞培養(yǎng)在膠原包被的培養(yǎng)瓶中,通過轉(zhuǎn)染慢病毒我們得到CD271過表達的表皮干細胞(CD271-vo eSCs)和CD271低表達的表皮干細胞(CD271-kd eSCs)以及轉(zhuǎn)染了空病毒的對照組表皮干細胞(Control eSCs)�？梢酝ㄟ^判斷帶有綠色熒光的細胞來判斷病毒是否轉(zhuǎn)染細胞成功,并可以粗略判斷轉(zhuǎn)染效率。免疫組織化學染色和Western blot結(jié)果顯示我們得到CD271-vo表皮干細胞和CD271-kd表皮干細胞以及對照組表皮干細胞。CD271在表皮干細胞的分化作用利用CK10、CK19和β 1的表達量多少來表示。當CD271過表達時,CK10表達升高而CK19表達下降,相反的,當CD271低表達時,CK10表達降低而CK19和βl表達升高。這些結(jié)果表明CD271可以有效的調(diào)控表皮干細胞的分化。(2)CD271調(diào)控表皮干細胞的增殖凋亡和遷移能力接下來我們檢測了 CD271對于表皮干細胞凋亡和增殖方面的影響。我們使用了流式細胞術(shù)、細胞克隆和CCK-8等方法檢測細胞的增殖。對比Control組表皮干細胞,CD271-vo表皮干細胞G2期增多,CD271-kd表皮干細胞G2期減少。在細胞克隆和CCK-8測細胞增殖的實驗中我們也可以得到類似的結(jié)果。表皮干細胞的凋亡能力用Hochest/PI染色、TUNEL/DAPI染色和流式細胞術(shù)檢測,得到跟增殖能力測定實驗觀點一致的結(jié)論。Transwell實驗用來檢測細胞的遷移能力,CD271-vo表皮干細胞的遷移能力增高而CD271-kd表皮干細胞遷移能力下降。這些結(jié)果顯示CD271促進了表皮干細胞的增殖能力和遷移能力。(3)CD271可以調(diào)節(jié)TrkA的表達TrkA是神經(jīng)生長因子的另一個受體。有研究表明TrkA和CD271表達的比率可以通過神經(jīng)生長因子影響細胞的增殖和存活。所以我們使用了免疫組織化學染色和Western blot對TrkA在細胞中的表達情況進行了檢測。當CD271表達增高時TrkA表達降低,當CD271表達降低時TrkA表達增高。(4)K252a抑制表皮干細胞的TrkA表達后,CD271過表達的表皮干細胞的凋亡能力增加前文已經(jīng)說到,K252a是抑制TrkA受體的試劑。通過轉(zhuǎn)染慢病毒和加藥,我們得到對照組的表皮干細胞(Control eSCs),CD271過表達的表皮干細胞(CD271 eSCs),與K252a共培養(yǎng)的正常表皮干細胞(K252a eSCs)和CD271過表達的表皮干細胞(CD271 eSCs+K252a)。通過流式細胞術(shù)檢測Control組,CD271 eSCs組,K252a eSCs組和CD271 eSCs+K252a組這四組細胞表達CD271的情況。我們采用流式細胞術(shù)測Q2+Q4的比率水平來比較各組之間凋亡能力。我們發(fā)現(xiàn)與不加K252a的Control組和CD271 eSCs組相比,加K252a后的兩組的Q2+Q4比率均增高,并且CD271過表達同時TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a組在各組中凋亡水平的增高是最明顯的。與TUNEL染色結(jié)果一致。TrkA抑制后即使CD271過表達,也會增加表皮干細胞的凋亡能力。(5)K252a抑制表皮干細胞的TrkA表達后,CD271過表達的表皮干細胞的增殖能力降低K252a是常用的抑制TrkA表達的抑制劑。通過Western blot判斷TrkA被抑制的效率,我們的實驗中TrkA完全抑制表達,然后再做流式細胞術(shù)測定細胞周期。我們發(fā)現(xiàn)與不加K252a組相比,加K252a后的兩組的G2期均下降,并且CD271過表達同時TrkA抑制的CD271 eSCs+K252a組在各組中是增殖能力降低最明顯的。與細胞克隆實驗結(jié)果一致。TrkA抑制后即使CD271過表達也可以降低表皮干細胞的增殖能力。(6)K252a抑制表皮干細胞的TrkA表達后,CD271過表達的表皮干細胞的遷移能力下降K252a是抑制TrkA受體的試劑。我們Transwell實驗測細胞穿膜的細胞數(shù)目水平來比較各組之間遷移能力。我們發(fā)現(xiàn)與不加K252a的Control組和CD271 eSCs組相比,加K252a后的K252a組和CD271+K252a組的穿過膜的細胞數(shù)目顯著減少,并且CD271過表達同時TrkA抑制的表皮干細胞組在各組中是穿出細胞數(shù)目是最少的。TrkA抑制后可以降低表皮干細胞的遷移能力,并且CD271過表達但TrkA不表達也會引起表皮干細胞的遷移能力下降。(7)抑制TrkA表達后,ERK和Akt信號通路的表達降低為了探索可能參與的信號通路,我們提取了 Control組的表皮干細胞,CD271 eSCs組的表皮干細胞,與K252a共培養(yǎng)的K252a eSCs組表皮干細胞和CD271eSCs+K252a組的表皮干細胞這四組細胞的蛋白。利用Western blot的方法測定了 pERK,pAkt和pJNK的蛋白表達水平變化。與Control組的表皮干細胞相比,pERK和pAkt在CD271 eSCs中表達增多,而且在CD271 eSCs+K252a中表達最少。同時發(fā)現(xiàn)表皮干細胞與K252a共培養(yǎng)時,pJNK表達增高,并且與CD271的表達高低無關(guān)。2、動物實驗(1)CD271在燒傷創(chuàng)面愈合過程中表達增多檢測CD271在創(chuàng)面愈合過程中的變化情況,CD271表達在創(chuàng)面愈合的中、后期表達越來越高。把在100°C沸水中浸的銅塊放在已經(jīng)剃除毛發(fā)的小鼠背部4秒鐘,得到深I(lǐng)I度燒傷的創(chuàng)面模型。深I(lǐng)I度燒傷會累及殘留了表皮干細胞的皮膚的表皮層及真皮層。通過檢測表皮干細胞的表面標記物(CK19、β1),我們發(fā)現(xiàn)表皮干細胞在創(chuàng)面愈合過程中不斷增加,參與創(chuàng)面愈合的過程。我們可以看到創(chuàng)面在第7天和14天時開始愈合,并在第21天時完全愈合。我們在創(chuàng)面愈合過程不同的階段取材,動態(tài)觀察創(chuàng)面愈合的過程。我們發(fā)現(xiàn)CD271在第7天的時候下降了,但是在第14天和21天時表達增高了。然而CK10在第7天的時候表達降低,而在第14天和21天時表達增高。而免疫組織化學染色顯示,CD271和CK19在創(chuàng)面愈合過程中主要表達在增厚的表皮層。β1在基底層也表達增高了。CK19的表達在第7天的時候減少了,在第21天的時候增加。這些結(jié)果表明伴隨著表皮干細胞的增加,CD271參與創(chuàng)面中、晚期愈合過程。(2)CD271過表達的表皮干細胞可以促進創(chuàng)面愈合通過CD271正常表達和CD271過表達的表皮干細胞干預創(chuàng)面愈合以此判斷CD271對創(chuàng)面愈合情況的影響。與注射CD271正常表達的表皮干細胞相比,注射CD271過表達的表皮干細胞的創(chuàng)面在愈合時間和愈合質(zhì)量上都有提升。這些結(jié)果表明CD271過表達的表皮干細胞更加可以促進創(chuàng)面愈合。(3)TrkA可以輔助CD271促進創(chuàng)面的愈合通過腹腔注射K252a(5ug/kg)得到TrkA表達缺失的小鼠,取小鼠皮膚提取蛋白,通過Western blot方法驗證得到皮膚中TrkA表達缺失的小鼠模型。制備好全層皮膚缺失的小鼠。愈合模型實驗:將小鼠分為給予正常表達表皮干細胞的正常對照組(Control組),給予CD271過表達表皮干細胞的CD271組,預處理過K252a的給予CD271正常表達的表皮干細胞的K252a組和預處理過K252a的給予CD271過表達的表皮干細胞的CD271+K252a組。在術(shù)后的當天、3天和5天的時候,Control組和K252a組給予CD271正常表達表皮干細胞,CD271組和CD271+K252a組給予CD271過表達表皮干細胞的處理。在創(chuàng)面的周邊皮膚5mm,注射到皮膚的真皮層。從第3天開始,我們可以看到CD271過表達組創(chuàng)面愈合最快,CD271+K252a愈合最慢,但是在TrkA阻滯后的情況下,CD271過表達并不能引起創(chuàng)面的愈合加快。取上述各組創(chuàng)面愈合第7天時的皮膚組織,進行相關(guān)的實驗得出,CD271+K252a組的創(chuàng)面愈合邊緣,集聚著數(shù)量最少的處在增殖期的細胞,和最少量的表皮干細胞。結(jié)論我們的實驗揭示了CD271促進表皮干細胞的分化、增殖和遷移,CD271在深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面愈合過程的中、后期,也就是再上皮化和重構(gòu)過程中的起著重要作用。目前的發(fā)現(xiàn)可以將CD271和表皮干細胞視作很有前途的治療創(chuàng)面愈合的靶點。CD271在創(chuàng)面的早期降低,而在中、后期增高,表明CD271在創(chuàng)面愈合的中、后期階段起作用。我們在創(chuàng)面愈合的早期通過表皮干細胞干預創(chuàng)面的愈合進程,得出表皮干細胞可以促進創(chuàng)面愈合,而CD271可以加速表皮干細胞的增殖分化和遷移,以此促進皮膚的創(chuàng)面愈合過程的結(jié)論。除此之外,神經(jīng)生長因子的另一個受體TrkA的表達在CD271過表達的表皮干細胞中表達降低了。之前的研究顯示TrkA的作用不明確,可能促進,也可能抑制細胞的生物學特性,也有實驗表明TrkA和CD271的比率會影響細胞的生物學行為。因此為了進一步明確TrkA在CD271促進創(chuàng)面愈合的作用,在后續(xù)的實驗中,我們抑制TrkA的表達后發(fā)現(xiàn)即使CD271的增高并不會引起表皮干細胞的促進創(chuàng)面愈合作用。即在CD271的過表達的情況下,TrkA受體的存在可能啟動了比率機制引起表皮干細胞的增殖和遷移。本實驗還展示了在促進創(chuàng)面愈合過程中,CD271和TrkA可能會通過ERK和Akt信號通路起作用。綜上所述,這項實驗闡述了 CD271可以通過促進表皮干細胞的增殖分化遷移促進創(chuàng)面愈合;CD271聯(lián)合TrkA在創(chuàng)面愈合過程中起著重要作用,而且表明了一個潛在的機制——在TrkA存在的條件下,CD271通過促進表皮干細胞的增殖和遷移進而可以促進皮膚創(chuàng)面的愈合。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R64
【圖文】：

圖１燒傷創(chuàng)面愈合過程中ＣＤ２Ｈ和表皮干細胞表達增Ａ在小鼠（５只）背部制作燒傷創(chuàng)面（直徑０．５厘米）后，在創(chuàng)面后２１天取材。將創(chuàng)面皮膚磨碎并提取蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測ＣＤ２７１、Ｃ和Ｐ邋１變化情況。Ｂ用ＩｍａｇｅＪ軟件分析Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ條帶灰度值，－ａｃｔｉｎ相比的相對蛋白表達比值作圖，ＡＮ０ＶＡ檢測，＊尸＜０．邋０５。逡逑５０逡逑

圖２燒傷創(chuàng)面愈合過程中ＣＤ２７１和表皮干細胞主要表達在Ａ－Ｂ在小鼠燒傷創(chuàng)面后第７天取材，做免疫組織化學染色。切片后進行ＣＤ２７１、ＣＫ１０、ＣＫ１９和Ｐ邋１的免疫組織化學染色，標尺為１２０邋ｙ的創(chuàng)面愈合皮膚的表皮層的免疫組織化學染色的圖片插在原圖片中

圖３培養(yǎng)和鑒定原代表皮干細胞逡逑Ａ將培養(yǎng)了邋３天、１０天的表皮干細胞拍照，標尺為１２０邋ｕｎｉ

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

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本文編號：2769537