【摘要】：【目的】本研究旨在探討一種自主研發(fā)、藥物緩釋性良好的Nafamostat/PLGA-PEG-PLGA載藥熱敏水凝膠修復脊髓損傷的有效性。通過測定其性質(zhì),分析其生物相容性,并將其局部注射于大鼠脊髓損傷區(qū)域進行評價,驗證該水凝膠載藥系統(tǒng)的安全性與應用效果,為脊髓損傷的修復提供新的思路�！痉椒ā�1.載藥熱敏水凝膠的制備與性質(zhì)測定:制備載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml),并觀察、記錄其相轉(zhuǎn)變溫度,驗證其隨溫度改變所發(fā)生的流變學變化,測定藥物緩釋能力。2.體外生物相容性實驗:將20%載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml)與海拉細胞共培養(yǎng)3天,鏡下觀察細胞形態(tài)、增殖情況變化,并通過MTT細胞毒性實驗,與單純Nafamostat溶液、未載藥熱敏水凝膠溶液、PBS溶液相對比,評價其對細胞活性的影響。3.水凝膠載藥系統(tǒng)修復脊髓損傷的有效性評價:利用Impactor model-II脊髓打擊器建立大鼠脊髓損傷(SCI)動物模型,損傷處局部注射20%載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml)10ml,于術(shù)前、術(shù)后的第1天、第3天、第5天,以及1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周,對大鼠進行BBB運動功能評分,術(shù)后8周,通過脊髓組織切片HE染色觀察大鼠脊髓損傷區(qū)域空洞面積,GFAP免疫組化染色觀察損傷中心星形膠質(zhì)細胞聚集情況,BDA順行示蹤觀測神經(jīng)纖維跨脊髓損傷區(qū)域能力,數(shù)字圖像采用Image pro plus 5.0、Image J 2.1專業(yè)圖像分析軟件進行處理,數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件SPSS 15.0進行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(Mean±SD)形式表示,顯著性差異使用ANOVA testing計算,P0.05被認為具有統(tǒng)計學意義�！窘Y(jié)果】1.水凝膠載藥系統(tǒng)的性質(zhì):載藥熱敏水凝膠溶液的凝膠溫度范圍為35-56℃。通過透射電鏡觀察水凝膠呈類似球型的膠束或膠束團,直徑在10到30 nm之間不等,藥物顆粒均勻分散在凝膠膠束或膠束團中間。通過動態(tài)流變學分析,證實儲能模量G’、損耗模量G”相交點約在34℃,此結(jié)果與試管倒置法測得的凝膠轉(zhuǎn)變溫度(35℃)接近。2.生物相容性評價:細胞毒性實驗中,Nafamostat/PLGA-PEG-PLGA與海拉細胞共培養(yǎng)1天,2天,3天的鏡下細胞形態(tài)未見明顯異常,增殖情況良好。通過MTT實驗可觀察到,20%載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml)相比20%的未載藥熱敏水凝膠溶液、10mg/ml的Nafamostat溶液與PBS溶液,與海拉細胞共培養(yǎng)3天,對于細胞相對活性的影響,各組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.運動功能評分:在脊髓損傷模型制備前,實驗動物的BBB評分為21分。手術(shù)造成脊髓受損,術(shù)后所有的實驗動物都表現(xiàn)出雙后肢的癱瘓,BBB評分0分。自脊髓損傷后1天至1周,各組BBB評分比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。術(shù)后2周,各組之間的分值比較出現(xiàn)統(tǒng)計學意義(P0.05)。至實驗結(jié)束,即術(shù)后8周時,載有Nafamostat的熱敏水凝膠組的BBB評分為12.10±0.88,明顯高于其他三組,即:單純熱敏水凝膠組10.40±0.84,單純Nafamostat組9.30±0.95,對照組7.70±0.82(P0.05)。4.組織形態(tài)學觀察:在脊髓損傷術(shù)后的8周,觀察脊髓組織的切片,可見對照組的大鼠脊髓損傷區(qū)域空洞面積最大,損傷區(qū)域的細胞形態(tài)最差,神經(jīng)纖維稀疏,大量瘢痕組織形成,損傷區(qū)面積明顯大于其余3組(P0.001)。單純熱敏水凝膠組,單純Nafamostat組的損傷區(qū)域都明顯減小,壞死組織、膠質(zhì)瘢痕、炎性組織也較對照組減少。而承載Nafamostat的熱敏水凝膠組損傷面積最小。5.免疫組化染色:術(shù)后8周,縱切脊髓組織,行GFAP免疫組化染色,觀察損傷中心,可見單純熱敏水凝膠組,單純Nafamostat組,承載Nafamostat的熱敏水凝膠組的GFAP陽性面積明顯小于對照組(P0.001),而承載Nafamostat的熱敏水凝膠組GFAP陽性面積較其他各組最小,具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。通過各組動物的BDA染色可觀察到,BDA染色陽性的皮質(zhì)脊髓束大部分走行于對側(cè)脊髓白質(zhì)的后索,承載Nafamostat的熱敏水凝膠組中,大鼠的神經(jīng)纖維可以跨過脊髓損傷區(qū)域,而其余各組跨損傷區(qū)域的神經(jīng)纖維則較少,其中對照組最少�！窘Y(jié)論】本團隊制備的承載Nafamostat的熱敏水凝膠溶液具有良好的藥物分散性,釋放藥物過程平穩(wěn)、緩慢,且具有良好的生物相容性。將載藥水凝膠局部注射于大鼠脊髓損傷部位,相比單純藥物的一過性局部應用,能夠通過藥物擴散與緩釋的方式更長時間作用于損傷局部,顯著改善脊髓損傷后大鼠的運動功能,縮小脊髓損傷區(qū)域空洞面積,減少星形膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘢痕生成,促進神經(jīng)突觸再生,調(diào)節(jié)脊髓損傷處微環(huán)境,起到修復脊髓損傷的作用。本研究為提高脊髓損傷修復效率提供了理論基礎。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2
【圖文】：

同溫度下熱敏水凝膠溶液形態(tài)觀察，（A）（B）兩圖左邊均為未載，右邊均為載藥熱敏水凝膠；（C）43℃時未載藥熱敏水凝膠發(fā)生沉敏水凝膠在 50℃依然為凝膠態(tài)圖 2. 未載藥和載藥熱敏膠溶液（20wt%）的 TEM 照片

不同溫度下熱敏水凝膠溶液形態(tài)觀察，（A）（B）兩圖左邊均為未載藥膠，右邊均為載藥熱敏水凝膠；（C）43℃時未載藥熱敏水凝膠發(fā)生沉淀熱敏水凝膠在 50℃依然為凝膠態(tài)C D

Nafamostat的累積釋放率

【參考文獻】

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1 彭岱;王漢東;;干細胞在脊髓損傷治療現(xiàn)狀與進展[J];醫(yī)學研究生學報;2013年11期

2 郝定均;謝恩;陳博;吳起寧;周麗君;張子如;竇榆生;;修復脊髓損傷的仿生多孔水凝膠的制備研究[J];生物骨科材料與臨床研究;2013年05期

3 黃成;楊建東;馮新民;李廣峰;李藝楠;肖海祥;孫鈺;;季銨鹽殼聚糖三維支架復合GNDF載間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化[J];中國組織工程研究;2013年42期

4 王海寶;馬學強;劉曾旭;王向東;劉德明;;許旺細胞-海藻酸鈉凝膠移植修復大鼠脊髓損傷(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年38期

5 廖列文;劉正堂;岳航勃;崔英德;;電場敏感智能水凝膠的研究進展[J];化工進展;2008年11期

6 程朝輝;鄭啟新;鄭瑾;郭曉東;吳永超;;移植定向誘導的人骨髓間充質(zhì)干細胞治療脊髓損傷[J];中華實驗外科雜志;2007年06期

7 紀江峰;馮世慶;;脊髓損傷動物模型研究進展[J];中華實驗外科雜志;2006年09期

8 趙育;陳國華;孫明昆;晉治濤;高從X&;;pH敏感性羥乙基甲殼素/聚丙烯酸水凝膠的制備及其釋藥性能研究[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2006年02期

9 程映華,梁晶,王曉冬,張沛云,鄭祖根,顧曉松;殼聚糖神經(jīng)干細胞復合物修復大鼠完全性脊髓損傷的組織學觀察[J];中華實驗外科雜志;2004年01期

10 李賢真,李彥鋒,朱曉夏,李柏年,劉剛;高分子水凝膠材料研究進展[J];功能材料;2003年04期

本文編號：2766388