【摘要】：【目的】本研究旨在探討一種自主研發(fā)、藥物緩釋性良好的Nafamostat/PLGA-PEG-PLGA載藥熱敏水凝膠修復(fù)脊髓損傷的有效性。通過(guò)測(cè)定其性質(zhì),分析其生物相容性,并將其局部注射于大鼠脊髓損傷區(qū)域進(jìn)行評(píng)價(jià),驗(yàn)證該水凝膠載藥系統(tǒng)的安全性與應(yīng)用效果,為脊髓損傷的修復(fù)提供新的思路�！痉椒ā�1.載藥熱敏水凝膠的制備與性質(zhì)測(cè)定:制備載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml),并觀察、記錄其相轉(zhuǎn)變溫度,驗(yàn)證其隨溫度改變所發(fā)生的流變學(xué)變化,測(cè)定藥物緩釋能力。2.體外生物相容性實(shí)驗(yàn):將20%載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml)與海拉細(xì)胞共培養(yǎng)3天,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖情況變化,并通過(guò)MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),與單純Nafamostat溶液、未載藥熱敏水凝膠溶液、PBS溶液相對(duì)比,評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞活性的影響。3.水凝膠載藥系統(tǒng)修復(fù)脊髓損傷的有效性評(píng)價(jià):利用Impactor model-II脊髓打擊器建立大鼠脊髓損傷(SCI)動(dòng)物模型,損傷處局部注射20%載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml)10ml,于術(shù)前、術(shù)后的第1天、第3天、第5天,以及1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周,對(duì)大鼠進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分,術(shù)后8周,通過(guò)脊髓組織切片HE染色觀察大鼠脊髓損傷區(qū)域空洞面積,GFAP免疫組化染色觀察損傷中心星形膠質(zhì)細(xì)胞聚集情況,BDA順行示蹤觀測(cè)神經(jīng)纖維跨脊髓損傷區(qū)域能力,數(shù)字圖像采用Image pro plus 5.0、Image J 2.1專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 15.0進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示,顯著性差異使用ANOVA testing計(jì)算,P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�！窘Y(jié)果】1.水凝膠載藥系統(tǒng)的性質(zhì):載藥熱敏水凝膠溶液的凝膠溫度范圍為35-56℃。通過(guò)透射電鏡觀察水凝膠呈類似球型的膠束或膠束團(tuán),直徑在10到30 nm之間不等,藥物顆粒均勻分散在凝膠膠束或膠束團(tuán)中間。通過(guò)動(dòng)態(tài)流變學(xué)分析,證實(shí)儲(chǔ)能模量G’、損耗模量G”相交點(diǎn)約在34℃,此結(jié)果與試管倒置法測(cè)得的凝膠轉(zhuǎn)變溫度(35℃)接近。2.生物相容性評(píng)價(jià):細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中,Nafamostat/PLGA-PEG-PLGA與海拉細(xì)胞共培養(yǎng)1天,2天,3天的鏡下細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常,增殖情況良好。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)可觀察到,20%載藥熱敏水凝膠溶液(Nafamostat含量10mg/ml)相比20%的未載藥熱敏水凝膠溶液、10mg/ml的Nafamostat溶液與PBS溶液,與海拉細(xì)胞共培養(yǎng)3天,對(duì)于細(xì)胞相對(duì)活性的影響,各組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分:在脊髓損傷模型制備前,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的BBB評(píng)分為21分。手術(shù)造成脊髓受損,術(shù)后所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都表現(xiàn)出雙后肢的癱瘓,BBB評(píng)分0分。自脊髓損傷后1天至1周,各組BBB評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。術(shù)后2周,各組之間的分值比較出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,即術(shù)后8周時(shí),載有Nafamostat的熱敏水凝膠組的BBB評(píng)分為12.10±0.88,明顯高于其他三組,即:單純熱敏水凝膠組10.40±0.84,單純Nafamostat組9.30±0.95,對(duì)照組7.70±0.82(P0.05)。4.組織形態(tài)學(xué)觀察:在脊髓損傷術(shù)后的8周,觀察脊髓組織的切片,可見對(duì)照組的大鼠脊髓損傷區(qū)域空洞面積最大,損傷區(qū)域的細(xì)胞形態(tài)最差,神經(jīng)纖維稀疏,大量瘢痕組織形成,損傷區(qū)面積明顯大于其余3組(P0.001)。單純熱敏水凝膠組,單純Nafamostat組的損傷區(qū)域都明顯減小,壞死組織、膠質(zhì)瘢痕、炎性組織也較對(duì)照組減少。而承載Nafamostat的熱敏水凝膠組損傷面積最小。5.免疫組化染色:術(shù)后8周,縱切脊髓組織,行GFAP免疫組化染色,觀察損傷中心,可見單純熱敏水凝膠組,單純Nafamostat組,承載Nafamostat的熱敏水凝膠組的GFAP陽(yáng)性面積明顯小于對(duì)照組(P0.001),而承載Nafamostat的熱敏水凝膠組GFAP陽(yáng)性面積較其他各組最小,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。通過(guò)各組動(dòng)物的BDA染色可觀察到,BDA染色陽(yáng)性的皮質(zhì)脊髓束大部分走行于對(duì)側(cè)脊髓白質(zhì)的后索,承載Nafamostat的熱敏水凝膠組中,大鼠的神經(jīng)纖維可以跨過(guò)脊髓損傷區(qū)域,而其余各組跨損傷區(qū)域的神經(jīng)纖維則較少,其中對(duì)照組最少�！窘Y(jié)論】本團(tuán)隊(duì)制備的承載Nafamostat的熱敏水凝膠溶液具有良好的藥物分散性,釋放藥物過(guò)程平穩(wěn)、緩慢,且具有良好的生物相容性。將載藥水凝膠局部注射于大鼠脊髓損傷部位,相比單純藥物的一過(guò)性局部應(yīng)用,能夠通過(guò)藥物擴(kuò)散與緩釋的方式更長(zhǎng)時(shí)間作用于損傷局部,顯著改善脊髓損傷后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能,縮小脊髓損傷區(qū)域空洞面積,減少星形膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘢痕生成,促進(jìn)神經(jīng)突觸再生,調(diào)節(jié)脊髓損傷處微環(huán)境,起到修復(fù)脊髓損傷的作用。本研究為提高脊髓損傷修復(fù)效率提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R651.2
【圖文】：

同溫度下熱敏水凝膠溶液形態(tài)觀察，（A）（B）兩圖左邊均為未載，右邊均為載藥熱敏水凝膠；（C）43℃時(shí)未載藥熱敏水凝膠發(fā)生沉敏水凝膠在 50℃依然為凝膠態(tài)圖 2. 未載藥和載藥熱敏膠溶液（20wt%）的 TEM 照片

不同溫度下熱敏水凝膠溶液形態(tài)觀察，（A）（B）兩圖左邊均為未載藥膠，右邊均為載藥熱敏水凝膠；（C）43℃時(shí)未載藥熱敏水凝膠發(fā)生沉淀熱敏水凝膠在 50℃依然為凝膠態(tài)C D

Nafamostat的累積釋放率

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2766388