【摘要】：【目的】脊髓損傷(spinal cord injuries,SCI)是骨科一種嚴重的創(chuàng)傷性疾病,其發(fā)病率高,致殘率高,目前尚無有效治愈的方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)可促進脊髓損傷的修復,但體外培養(yǎng)的BMSCs細胞生物活性較低,對BMSCs進行優(yōu)化以提高移植效果是研究的熱點。本研究旨在通過利用自主搭建的低強度脈沖超聲(Low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)干預系統(tǒng),輸出不同強度超聲以激勵BMSCs,觀察細胞形態(tài)變化,檢測BMSCs增殖活性改變,得到LIPUS最佳干預優(yōu)化條件,獲得優(yōu)化LIPUS-BMSCs種子細胞;檢測LIPUS干預后BMSCs細胞凋亡以及神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophic factors,NTFs)表達的改變,以研究LIPUS對BMSCs的激勵作用。移植優(yōu)化的LIPUS-BMSCs修復大鼠脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI),評價細胞移植后大鼠的后肢運動功能、組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和損傷局部NTFs的表達,探討LIPUS促進BMSCs細胞移植修復SCI的機制�！痉椒ā�1.體外實驗BMSCs的提取和培養(yǎng):從Wistar大鼠獲取BMSCs,全骨髓貼壁篩選法純化細胞,并進行體外培養(yǎng)、擴增。通過流式細胞技術(shù)檢測CD29、CD90、CD34、CD45鑒定BMSCs。LIPUS超聲設(shè)備建立:自主搭建LIPUS細胞干預系統(tǒng),包括電源,信號發(fā)生器、信號放大器和超聲換能器,以超聲示波器檢測超聲波形和超聲強度。設(shè)定不同LIPUS干預強度激勵BMSCs,光鏡下觀察細胞狀態(tài)。通過檢測不同強度LIPUS干預下體外培養(yǎng)的BMSCs增殖活性的改變,確定最佳LIPUS干預條件。BMSCs細胞生物活性的檢測:TUNEL法檢測超聲干預后BMSCs的細胞凋亡狀態(tài)。蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)法檢測NTFs表達量的變化。2.體內(nèi)實驗動物模型建立和分組:36只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、對照組、BMSCs移植組和LIPUS-BMSCs移植組,采用脊髓挫傷模型。大鼠SCI后7天,分別對BMSCs移植組、LIPUS-BMSCs移植組大鼠進行BMSCs和LIPUS-BMSCs細胞移植。對照組大鼠注射DMEM/F12,假手術(shù)組大鼠脊髓暴露后不進行脊髓挫傷,且不進行細胞移植或培養(yǎng)液注射。細胞移植效果評價:通過BBB量表評價假手術(shù)組、對照組、BMSCs移植組和LIPUS-BMSCs移植組大鼠的后肢運動功能。各組取脊髓組織做HE染色、免疫熒光、ELISA,檢測脊髓組織結(jié)構(gòu)改變和損傷脊髓中心NTFs的表達。【結(jié)果】1.LIPUS超聲干預系統(tǒng):本研究成功搭建LIPUS超聲干預系統(tǒng),可體外優(yōu)化BMSCs。檢測BMSCs增殖活性改變,確定LIPUS最佳干預強度為50mW/cm~2。2.細胞生物學活性:提取原代BMSCs細胞狀態(tài)良好,細胞鑒定證實第三代BMSCs純度在95%以上。LIPUS干預可提高BMSCs的增殖活性,而細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。LIPUS干預后NTFs合成增加,其中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)的表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義。3.行為學評估:細胞移植后21天,BMSCs移植組、LIPUS-BMSCs移植組BBB評分高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。細胞移植后28天,BMSCs移植組和LIPUS-BMSCs移植組之間BBB評分差異有統(tǒng)計學意義,LIPUS-BMSCs更好的促進了大鼠后肢運動功能的恢復。4.組織學觀察:細胞移植后,尤其是LIPUS-BMSCs移植組,脊髓空洞減小,脊髓灰質(zhì)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)有所恢復,神經(jīng)纖維存活增加,軸突增生活躍,反應性膠質(zhì)細胞增生減少。ELISA檢測證實LIPUS-BMSCs細胞移植后,脊髓局部BDNF、NGF表達水平提高,其效果優(yōu)于BMSCs移植組,差異有統(tǒng)計學意義�！窘Y(jié)論】本研究體外實驗表明,利用自主搭建的LIPUS超聲干預系統(tǒng)激勵BMSCs可以提高細胞增殖活性,增加NTFs表達,為細胞移植修復SCI提供了大量優(yōu)化的LIPUS-BMSCs種子細胞。BMSCs移植后,大鼠的運動功能得到了改善,損傷脊髓局部組織結(jié)構(gòu)有所恢復,NTFs表達提高,促進了損傷脊髓的修復。同時,LIPUS-BMSCs的效果明顯優(yōu)于BMSCs。實驗證明LIPUS作為一種體外激勵方法可以在一定程度上提高BMSCs在SCI修復中的作用,且具有無創(chuàng)、安全的優(yōu)點,為SCI修復的細胞移植的種子細胞優(yōu)化提供了新的手段。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2
【圖文】：

大鼠BMSCs

BMSCs細胞鑒定

LIPUS超聲干預示意圖及設(shè)備圖

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本文編號：2765312