【摘要】：創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)后血管損傷是TBI關(guān)鍵的原發(fā)事件,可引起一系列繼發(fā)損傷,是TBI修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。成功的血管再生為神經(jīng)元再生和重塑提供關(guān)鍵的神經(jīng)血管微環(huán)境,此過程中其產(chǎn)生的有效灌注可以清除損傷因子,促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)運(yùn),為神經(jīng)元和突觸的再生提供營(yíng)養(yǎng),有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此,近年來TBI治療的促血管生成策略越來越受到人們的關(guān)注。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)及一氧化氮合酶(i NOS)等靶基因的轉(zhuǎn)錄,是低氧條件時(shí)血管系統(tǒng)應(yīng)答的調(diào)節(jié)中心。相關(guān)研究證實(shí),HIF-1α在大鼠缺血性心肌損傷和腦損傷模型中可以誘導(dǎo)新生血管的形成,然而HIF-1α在TBI后的表達(dá)情況及其在血管再生中的作用機(jī)制尚不明確,本研究旨在探討HIF-1α在大鼠TBI模型中的表達(dá)情況及血管再生過程中的作用和機(jī)制。第一部分大鼠顱腦損傷后缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)規(guī)律及其表達(dá)機(jī)制目的觀察大鼠顱腦損傷后缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律,并探討其可能的表達(dá)機(jī)制。方法將56只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=8只)、假手術(shù)組(n=8只)、創(chuàng)傷性顱腦損傷組(TBI組,n=40只),通過改良Feeney法建立顱腦損傷(TBI)模型,TBI組按從受傷到處死時(shí)間的長(zhǎng)短分為TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d和TBI-14d共5個(gè)亞組,每個(gè)亞組8只大鼠,用正常大鼠作為Sham組,假手術(shù)組僅切開皮膚及打開骨窗,保證硬膜完整,不進(jìn)行打擊損傷。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測(cè)模型建立后HIF-1αm RNA、蛋白質(zhì)及上游調(diào)控因子脯氨酸羥化酶區(qū)域蛋白2(Prolyl Hydroxylase Domain Protein 2,PHD2)的表達(dá)情況;采用HE染色觀察TBI模型建立后病灶的病理變化,采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)挫傷灶及周圍腦組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果(1)RT-PCR對(duì)照組、假手術(shù)組以及TBI組SD大鼠腦組織中均檢測(cè)到HIF-1αm RNA的表達(dá),三組表達(dá)無明顯差異(p0.05);與對(duì)照組相比,TBI-24h、3d HIF-1αm RNA表達(dá)明顯增高(P0.01),TBI-6h、7d、14d無明顯差異(p0.05);(2)Western blot對(duì)照組、假手術(shù)組未檢測(cè)到HIF-1α蛋白的表達(dá)。PHD2蛋白于sham組及假手術(shù)組正常表達(dá),于TBI組中明顯降解,三組表達(dá)差異明顯(P0.05);(3)免疫組化對(duì)照組、假手術(shù)組未檢測(cè)到HIF-1α蛋白表達(dá),顱腦損傷后挫傷灶及周圍腦組織HIF-1α表達(dá)增加,陽性表達(dá)主要位于神經(jīng)元細(xì)胞胞核內(nèi);TBI組各亞組于TBI-6h開始表達(dá),于TBI-3d到達(dá)表達(dá)高峰,TBI-7d開始下降,至TBI-14d恢復(fù)至損傷前水平;結(jié)論顱腦損傷后各種病理過程導(dǎo)致腦組織缺血缺氧,誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)增加,其表達(dá)調(diào)控機(jī)制為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,PHD2蛋白的降解使HIF-1α的表達(dá)增加。第二部分2-ME-2對(duì)大鼠顱腦損傷缺氧誘導(dǎo)因子-1α及其下游血管再生相關(guān)因子表達(dá)的影響目的通過檢測(cè)予以二甲基雌氧二醇(2-methoxyestradiol,2-ME-2)干預(yù)后大鼠損傷灶及周圍腦組織中HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9和CD31表達(dá)的變化,探討HIF-1α在TBI后大鼠血管新生中可能起到的作用。方法成年健康SD大鼠80只,隨機(jī)分為TBI組和TBI+2-ME-2組,每組40只,兩組均參照改良Feeney自由落體法制作大鼠顱腦損傷模型。根據(jù)傷后處死時(shí)間分別將兩組隨機(jī)分6h、24h、3d、7d和14d共5個(gè)亞組,每亞組各8只。TBI+2-ME-2-6h、24h亞組于模型制作成功后即刻腹腔注射2-ME-2(2.5mg/kg)一次,3d、7d和14d亞組于傷后注射一次,連續(xù)于傷后2天各注射一次,TBI組于同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量DMSO。每亞組隨機(jī)取四只大鼠處死后取挫傷灶及周圍腦組織通過Western blot技術(shù)檢測(cè)HIF-1α在兩組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況;通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HIF-1α、VEGF、Ang-1、MMP-9的表達(dá)情況;剩余的4只大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化,采用免疫組織化學(xué)方法(SP法)檢測(cè)挫傷灶及周圍腦組織中CD31蛋白的表達(dá)情況,應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果(1)Western blot大鼠TBI模型制作成功后6h HIF-1α蛋白表達(dá)開始增加,24h到3d內(nèi)達(dá)到高峰,14d恢復(fù)至損傷前水平;使用HIF-1α阻滯劑2-ME-2干預(yù)后HIF-1α在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較損傷組均明顯下降(p0.01,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);(2)RT-PCR①損傷組和抑制劑組HIF-1αm RNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變(p0.05);②VEGF在損傷組6h表達(dá)增加,7d和14d高表達(dá),使用2-ME-2干預(yù)后VEGF m RNA水平較損傷組明顯降低(p0.05,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);③Ang-1 m RNA的表達(dá)水平:損傷組Ang-1m RNA在TBI后早期表達(dá)不明顯,7d、14d表達(dá)明顯增加,說明Ang-1參與新生血管的成熟調(diào)控,使用2-ME-2干預(yù)后Ang-1 m RNA水平較損傷組表達(dá)明顯降低(p0.01,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);④TBI組MMP-9 m RNA的表達(dá)水平:MMP-9在損傷組6h表達(dá)增加,24h達(dá)高峰,并處于高峰狀態(tài)達(dá)3d,7d表達(dá)開始下降,14d表達(dá)較前明顯降低,2-ME-2干預(yù)后MMP-9m RNA水平在TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-7d上表達(dá)較損傷組明顯降低(**p0.01、*p0.05,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);(3)免疫組化TBI組SD大鼠腦組織CD31的表達(dá),在TBI-6 h、24h、3d表達(dá)不明顯,TBI-7d、TBI-14d表達(dá)明顯增加,TBI-2-ME-2組TBI-7d、TBI-14d挫傷灶及周圍腦組織CD31蛋白表達(dá)較TBI組均明顯下降(P0.05)。結(jié)論創(chuàng)傷性顱腦損傷后HIF-1α表達(dá)增加,誘導(dǎo)血管再生相關(guān)基因VEGF、Ang-1的表達(dá),促進(jìn)損傷血管的修復(fù)和再生。然而HIF-1α也可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá)加重腦水腫的程度。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R651.15
【圖文】：

�。�?1：HIF-1α在血管形成過程中可能起到的作用概略圖1、HIF-1 因子和內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Precursor Cells, EPCs)在成年哺乳動(dòng)物，內(nèi)皮祖細(xì)胞多存在于骨髓，妊娠婦女的臍帶血，羊水和胚胎中，在理化因素刺激下，可以從骨髓動(dòng)員并遷徙到外周循環(huán)血中，進(jìn)而歸巢到損傷組織參與損傷器官血管的修復(fù)，這為血管損傷相關(guān)性疾病的研究治療提供了新的思路。EPCs 跟成骨細(xì)胞、造血干細(xì)胞等一起位于骨髓提供的微環(huán)境里，在受到缺血缺氧刺激時(shí)增殖增加，并動(dòng)員進(jìn)入外周血，最終募集、歸巢進(jìn)入損傷組織[12]；EPO 是一類由成人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和胚胎造血細(xì)胞合成分泌的細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子被釋放入血后能進(jìn)入骨髓進(jìn)而調(diào)控紅細(xì)胞的生成抑制造血祖細(xì)胞的凋亡。低氧刺激 HIF-1α表達(dá)上調(diào)后與 EPO 編碼基因低氧結(jié)合區(qū)域結(jié)合后激活 EPO 表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用[13]。此外，最近的研究部分也證實(shí)了 HIF-1α-SDF-1/CXCR 通路在 EPCs

圖 1：A 動(dòng)物手術(shù)臺(tái)、實(shí)驗(yàn)用手術(shù)器械、骨蠟、剪刀、“T”形撞墊(上端直徑為 5mm 的圓形，下端為 3×3×2.5mm 的立方柱)等輔助器械；B 實(shí)驗(yàn)用高速顯微磨鉆；C 自制自由落體裝置及自制撞墊(導(dǎo)管長(zhǎng)度 30cm，可根據(jù)打擊程度調(diào)節(jié)導(dǎo)管高度)超低溫冰箱(LEGACI，美國(guó))；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(DY-891，寧波新芝)；移液器槍一套(Eppendorf Reference，1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl)；分光光度計(jì)(UV-2000，美國(guó) UNICO)；高速冷凍離心機(jī)(KDC-210HR)；基因擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System9700)；電泳儀；量筒、燒杯、三角燒瓶等。電子分析天平(BS224S，德國(guó)賽多利斯)；病理組織漂烘儀(PHY-Ⅲ，常州中威)；石蠟切片機(jī)(Leica，德國(guó))；光學(xué)顯微鏡(Zeiss Axio Scope. A1，德國(guó)蔡司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HG303-4K，南京)。1.2 主要試劑總mRNA提取用Trizol試劑由美國(guó)Invitrogen公司購(gòu)得；100次cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

缺氧誘導(dǎo)因子-1α在創(chuàng)傷性顱腦損傷后血管再生過程中的作用及機(jī)制研究 第一部分2、手術(shù)刀片切開皮膚，長(zhǎng)約 3cm，取右側(cè)顱頂旁正中切口，利用眼科組織剪游離軟組織、剝離骨膜，暴露 0.5cm2大小的顱骨，定位于前囟后 1.5mm、矢狀縫右側(cè)2.5mm 為中心。3、利用顯微手術(shù)用電動(dòng)磨鉆進(jìn)行顱骨開窗，利用蚊式鉗將骨窗擴(kuò)大至 5mm×5mm的正方形骨窗(注意：操作過程中要保持硬腦膜完整)。4、解開大鼠固定的四肢，使其俯臥于動(dòng)物臺(tái)上，取自制“T”形撞墊(下端為3×3×2.5mm 的立方柱，上端直徑為 5mm 的圓形，下端立方柱可自由進(jìn)出骨窗)下端置入已打開骨窗。5、將大鼠頭左偏，以保證“T”形撞墊平面與動(dòng)物臺(tái)平行，將導(dǎo)引管中心正對(duì)“T”形撞墊中心安放自由落體打擊導(dǎo)引管，25g 砝碼沿高 30cm 的自由落體導(dǎo)引管落下，直接撞擊撞墊進(jìn)行一次打擊(撞擊能量為 750g cm)，造成局灶性顱腦損傷。6、模型制作成功后，使用醫(yī)用雙氧水、碘伏反復(fù)沖洗傷口，無菌醫(yī)用骨蠟封閉

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 江榮才;;促血管生成可能是腦外傷治療的新策略[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年23期

本文編號(hào)：2750490